除皱短肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域重组蛋白的设计和制备方法，具体是一种新型除皱短肽及其制备方法。
【背景技术】
[0002]人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。表皮没有血管，细胞的能量和营养必须由真皮微循环提供。真皮层是皮肤的生命源泉，是一层致密、坚韧且有弹性的组织，主要由纤维成分(胶原蛋白纤维、弹力纤维和网状纤维)、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等组成。
[0003]人类研宄证实，皱纹的产生与面部肌肉纤维过度刺激有关。因此，从理论上来讲，可以通过直接减少肌肉运动收缩来减轻皱纹的产生。肌肉的收缩是由神经递质调控的，而SNARE复合物则是神经递质传递的信号来源。目前市场上广泛使用的肉毒素正是通过抑制SNARE复合物的功能抑制神经细胞的活性，进而达到去除皱纹的目的。但是，肉毒素的副作用非常巨大，人类一直在研宄肉毒素的功能类似物，力求在达到相同目的的前提下尽量减少其副作用。
[0004]Lipotec公司发现的Argireline就是一种肉毒素的功能类似物。Argireline由6个氨基酸组成，氨基酸组成为AC-EEMQRR-NH2。功能实验证实，Argireline有很好的皮肤渗透性，并可以有效抑制SNARE的功能，具有很强的抗皱去皱活性，也被称为六胜肽。
[0005]目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了 Argireline六胜肽作为除皱的有效成分。我国一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前六胜肽的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加高效的除皱短肽，并探索大规模制备除皱短肽的技术。
【发明内容】
[0006]本发明为了提高现有除皱短肽的生物学活性，同时降低这类美容肽的生产成本，提供了一种新型除皱短肽的设计方案，并提供其大规模的制备方法。
[0007]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种除皱短肽，由14个氨基酸所组成，其氨基酸序列为:Gly-Pro-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用单字符号表示为 GPEEMQRRLEVLFQ，简称为 E14 短肽，理论分子量为1.732kD。
[0008]上述E14短肽可以通过多种生产工艺进行制备:
1、利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的E14，简称rE14，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。
[0009]2、利用化学合成的工艺合成E14，简称sE14，成本较高，但是具有与rE14类似的生物学功能。
[0010]本发明提供上述的除皱短肽的制备方法，包括如下步骤:
(1)、大肠杆菌基因工程菌的构建
1.1、设计 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Glu-Glu-Met-Gln-Arg -Arg(用单字符号表示为LEVLFQGPEEMQRR)氨基酸序列为基本重复单元L14构建蛋白序列pL14_n，其中η为1-100的任意数值；
1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL14，(ctggaggtgctgtttcagggtccggaagagatgcagcgtcgc)n；
1.3、将核苷酸序列nL14克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；
(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养
2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于LB培养基中35?38°C培养过夜；
2.2、将菌液接种放大培养，35?38°C培养2.5?3小时，加入IPTG进行诱导，15?18°C继续培养18?22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL14-n，离心收集菌体；
(3)重组除皱短肽rE14的纯化
3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；
3.2、利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到除皱短肽rE14 本发明所述的rE14短肽检测纯度如下:
除皱短肽rE14理论分子量为1732Da，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALD1-TOF AXIMA-CFR Plus(KRATOS Analytical，Shimadzu corporat1n, Japan)在线性模式下进行分析。分析结果如图3所示。
[0011]与现有技术相比，本发明制备的除皱短肽rE14具有以下特点:
1、本发明所公开的新型除皱短肽E14(GPEEMQRRLEVLFQ)，为长期筛选优化的序列，水溶性好，稳定性强。
[0012]2、本发明所公开的新型除皱短肽rE14的制备方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量。
[0013]3，本发明所公开的新型除皱短肽E14的制备方法，产物纯度高，利用质谱方法检测无明显杂质成分。
[0014]综上所述，本发明公开的除皱短肽E14水溶性好，稳定性强，纯度高，生产工艺简单，成本低廉，能够让除皱皮肤产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。
【附图说明】
[0015]图1表示表达载体pGEX-6p-nL14-9的质粒构建图谱。
[0016]图2 SDS-PAGE电泳表示rE14的纯化过程。在酶切前，谷胱甘肽亲和柱上为GST-pL14-9的重组蛋白，加入PPase酶切之后，柱材上只剩PPase酶和GST标签蛋白，rE14被洗脱收获(因分子量小，无法利用SDS-PAGE鉴定)。
[0017]图3表示提纯产物中除皱短肽rE14的质谱鉴定结果。rE14的理论分子量为1732Da，与质谱检测结果完全吻合。
[0018]图4表示室温放置4周之后，提纯产物中除皱短肽rE14的质谱鉴定结果。rE14显示出标准分子量1732Da，证明没有明显降解。
【具体实施方式】
[0019]下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
[0020]一种除皱短肽的制备方法，包括如下步骤:
(I)、大肠杆菌基因工程菌的构建
1.1、为了酶切之后获得除皱短肽rE14，特别设计氨基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GIn-Gly-Pro-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg 为基本重复单元 L14，构建蛋白序列 pL14_n。
[0021]这种单元的重复数目与最终短肽的收获量成正比关系。通常可以采用1-100个重组单元进行构建，这样构建的目的蛋白序列(LEVLFQGPEEMQRR) n简写为pL14_n，其中η为1-100的任意数值；实验证明当η=9时，除皱短肽rE14的得率较高。
[0022]本实施例以9个重复单元为例进行说明，9个重复单元的蛋白序列pL14-9为(LEVLFQGPEEMQRR)9:
LEVLFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRLEV
LFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRLEVLFQGPEEMQRRo
[0023]1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL14，并按照大肠杆菌有利的密码子进行优化，获得核苷酸序列nL14-9如SEQ ID N0.1所示:
ctggaagtgctgttccaaggtccggaagagatgcagcgtcgcctggaagtgctgttccagggtcctgaggaa