用于体外测试发育毒性的方法和系统的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年9月28日提交的新加坡专利申请第201207242-7号的权益， 其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于发育毒性测试的方法和系统。
【背景技术】
[0004] 以下关于本发明【背景技术】的论述意在帮助对本发明的理解。但是，应当理解，在任 何司法管辖权中，在本申请的优先权日，此论述不确认或不承认所涉及的任何材料是已发 表的、已知的、或者作为公知常识的一部分。
[0005] 先天缺陷是全世界新生儿死亡的主要原因之一 K2、3,其还会导致长期的残疾和疾 病。胎儿发育期畸形可以归因于遗传条件或怀孕期间，特别是前三个月时的环境暴露。因 此，监管部门，例如美国环境保护署（EPA)，已经要求评价环境因素，例如药物、化学品和杀 虫剂的发育毒性4。
[0006] 在动物上测试发育毒性受成本和伦理问题的限制。因此，开发出一些替代性的基 于动物胚胎或细胞的体外发育模型，其包括青蛙胚胎畸形生长测定（FETAX)5,鸡胚胎毒性 筛选测定（CHEST)6,使用小鼠胚胎间充质细胞的微团（MM)测定7,小鼠或大鼠全胚胎培养 (WEC)测定8,斑马鱼胚胎幼体发育毒性测定9,以及小鼠胚胎干细胞测试（EST)1(I。
[0007]根据欧洲替代方法验证中心（ECVAM)，只有用于胚胎毒性测试的MM测定、WEC以及 小鼠EST是经过科学验证的，并可以考虑用于监管性接受和可施用1h3。然而，物种间的差 异导致无法充分解释人类和动物胚胎发育在分子调控上的差别，或者当用于生殖毒性测试 时，产生带来灾难性后果的假阴性结果。例如，被召回的药物，沙利度胺，在人类中引起发育 畸形而在小鼠中不会 14。本技术的目的在于提供用于发育毒性研宄和筛选应用的基于人类 细胞的发育模型。
[0008] 虽然还未成功的开发出人类EST，但已经开始尝试使用人胚胎干细胞（hESC)代替 用于EST检测的小鼠ESC16'17。小鼠EST的核心标准是基于对小鼠胚胎干细胞（mESC)分化 成跳动的心肌细胞的影响评价化合物的毒性1(1。使用小鼠ES细胞系D3和小鼠胚胎成纤维 细胞系3T3,它们尝试测量两个细胞系的细胞毒性抑制值（IC5(I)以及mESC的分化抑制值 (ID5CI)。进一步使用经验证的预测模型将药物化合物分成三类，"无胚胎毒性"，"弱胚胎毒 性"和"强胚胎毒性"。整个过程持续10天，用传统的在显微镜下的跳动的心肌细胞监测，或 者持续7天使用FACS检测心肌组织的基因表达。一个主要的原因是hESCs以缓慢的速率 在体外分化成心肌细胞，较mESCs更耗时（30天后达10-25 % )18,这使得不可能在第10天 对跳动的心肌细胞计数。使用RT-PCR或免疫染色法，研宄人员可以获取描述发育毒素作用 的数据。然而，缺少合适的评分系统使其在药物测试应用中仍不令人满意。
[0009] 2010年，Cezar的团队使用代谢组学和随机森林模型，首次成功将药物分类为发 育毒素和非发育毒素19。然而，他们仅在hESC多潜能维持培养基（例如mTeSRl培养基）中 测试了那些药物而没有在实际分化的hESC中测试，并且由于仅在实验中使用流传的浓度 的药物，他们未能将那些发育毒素进一步分类为弱或强发育毒性化合物。
[0010] 目前基于细胞的丽和EST测定可以潜在地包括人胚胎的细胞或者多潜能的细胞， 但是在这些模型中，发育过程（例如细胞分化成3个胚层）是自发且无序的。因此，它们没 有提供灵敏并可靠的分类发育毒素的方式，所述发育毒素包括胚胎毒素和致畸物，因为所 述测定测量一般的细胞毒性 7或心肌组织形成的抑制程度1(1，其太粗糙以致无法获取发育 毒性的重要方面-分化图案的干扰。目前的EST模型依靠外源物作为发育毒性指示剂测量 心肌细胞形成的抑制。因此它无法与hESC的固有性质相兼容，因为hESC无法像小鼠ES细 胞一样容易地形成心肌细胞。
[0011] 本发明的目的是改善此处提到的至少一个问题。
【发明内容】
[0012] 在整个文件中，除非有另外相反的陈述，术语"包含"、"包括"等表述理解为非穷尽 性列举，或换句话说，是指"包括但不限于"。
[0013] 本技术包括一种体外测试发育毒性的方法，其包括以下步骤：
[0014] a.微图案化细胞外基质；
[0015] b.在存在中内胚层诱导培养基的情况下，使胚胎干细胞在微图案化细胞外基质上 生长，以形成几何形状的中内胚层结构；以及
[0016] c.在存在或不存在测试化合物的情况下，测试几何形状的中内胚层结构的变化， 其中，与不存在测试化合物的细胞相比，在存在测试化合物的情况下，（1)中内胚层细胞分 化减少和/或（2)几何形状的中内胚层结构的形态学变化表明测试化合物是发育毒性剂。
[0017] 中内胚层诱导剂用于模拟一种早期胚胎发育过程（原条形成）。这种方法的优点 可能是有多于一个发育毒性作用的定量描述符。
[0018] 参考以下提及的优选实施方式的说明性附图，回顾后面的说明书，本领域技术人 员清楚本发明的其他方面和优点。
【附图说明】
[0019] 本发明的优选实施方式将参考下述附图，仅以说明性实例的方式描述：
[0020] 图1 :用聚二甲基硅氧烷（PDMS)模板使细胞图案化。
[0021] 图2 :分化3天后形成与hESC集落形状相同的几何形状的中内胚层结构。（a)、 (b)、（e)、（f)是面积为 785000ym2 的hESC集落；（c)、（d)是面积为 196250ym2hESC集落。 红色：中内胚层标记物Brachyury的免疫焚光染色；比例尺：200ym。
[0022] 图3 :共焦扫描hESC集落的边缘（圆形）。红色：Brachyury，蓝色：DAPI。（a) 3-D 重建显示Brachyury阳性细胞位于hESC集落的边缘，形成闪亮的"环形物";(b)Z堆叠表明 Brachyury阳性细胞仅位于细胞片层的顶层，并且在闪亮的"环形物"下方有"管状"结构。 比例尺：30ym。
[0023] 图4 :在药物处理/无药物处理的条件下，分化3天后Brachyury的表达情况。用 5-氟尿嘧啶（5-FU) (b)，丙戊酸（VPA) (c)或沙利度胺（d)处理后，T表达错误定位。比例 尺：100ym〇
[0024] 图5:非对称比例计算。首先使用未处理的hESC集落获得环（a)&b)中的红色）的 半径，然后用这个环作为经致畸剂处理的hESC集落的遮盖物（c)，分别计算两种非对称比 例并比较相对变化。
[0025] 图6:相对于未处理的对照，致畸剂诱导发生的非对称比例变化。a)致畸剂处理或 无致畸剂处理的非对称比例值。b)与未处理对照组相比，致畸剂处理后的相对非对称比例 变化。0. 05μg/ml5-FU的非对称比例下降了 46. 7%，从3降至1.6 ;0.ImM丙戊酸和0. 8mM 沙利度胺的不对称比例下降了 70%，从3降至~0. 9。
[0026] 图7:微图案化的不同hESC细胞系形成的几何形状的中内胚层结构的图像。（A): 分化3天后微图案化的H9hESC。（B)分化3天后微图案化的HlhESC。
[0027] 图8:通过空间图案化分化然后协调的形态发生性细胞运动形成几何形状的中内 胚层结构。（A)第1天至第3天（D1-D3)微图案化的hESC(yp-hESC)集落的相位和荧光图 像。中内胚层（T+)细胞第1天在集落边缘空间图案化，然后在第3天从展示为距集落边缘~ 150-200ym。（B)分化3天后其他中内胚层标记物的空间图案化。Wnt3a、Fgf8、Criptol(绿 色）与T(红色）共定位于yP-hESC集落中。（C)上皮细胞-间充质转化（EMT)标记物在 yP-hESC集落的边缘和中心周围的转录水平。与集落中心的细胞相比，yP-hESC集落边 缘附近的细胞具有更高的诸如Snail和波形蛋白的EMT标记物表达水平。Brachyury(T)、 Wnt3a、Fgf8和Criptol全部是中内胚层标记物。（D)在10X物镜下的yP-hESC集落3天 活体成像的拼集的照片显示3天分化过程中细胞运动。（E)在3天活体成像窗口中沿着图 1D上的集落的黄线进行的波动曲线记录图分析。集落边缘附近的细胞显示在第2天出现随 机细胞迀移，但是在第3天经历了定向的集合性细胞运动。
[0028] 图9:发育毒性药物影响yP-hESC模型中中内胚层结构的物理形态学/位置。 (A):药物处理的yP-hESC集落的波动曲线记录图。发育毒性药物处理（沙利度胺&VPA) 下的集合性细胞迀移轨迹在第2-3天受到干扰，而在非发育毒性药物处理（青霉素G)下的 集合性细胞迀移未受影响。（B):有/没有药物处理的情况下，中内胚层标记物T在第3天 的位置。当使用沙利度胺或VPA处理时，中内胚层图形（T+区域）的位置发生错位，然而使 用阴性对照药物青霉素G时保持不变。比例尺：100ym。
[0029] 图10 :发育毒性药物引起的剂量依赖性发育毒性应答的PCA结果。（A-C):当使用 视黄酸（狀，>=〇.〇〇36以/1111)、沙利度胺（>=30〇1^)或￥?六（>=0.81111)处理时，显 著干扰uP-hESC集落内的中内胚层图形的空间分布。（D):即使浓度达到1000 μg/ml时， 青霉素G药物处理也不能显著干扰yP-hESC集落内的中内胚层图形的空间分布。
[0030] 图11 :基于PCA和细胞毒性测试（MTS)结果的药物分类结果。（A)RA的有效浓度 (能显著干扰yP-hESC模型中的中内胚层图形的空间位置的最低药物浓度）（ecka)是~ 0. 0036yg/ml，