。
[0111] 图8B显示分化3天后其他中内胚层标记物的空间图案化；Wnt3a、Fgf8、 Criptol(绿色）与T(红色）共定位于yP-hESC集落中。图8C显示上皮细胞-间充质转 化（EMT)标记物在yP-hESC集落的边缘和中心周围的转录水平。与集落中心的细胞相比， yP-hESC集落边缘附近的细胞具有更高的诸如snail和波形蛋白的EMT标记物表达水平。 Brachuary(T)、Wnt3a、Fgf8和Criptol全部是中内胚层标记物。空间图案化的分化通过中 内胚层标记物Brachyuary、Fgf8、Criptol和Wnt3a(图8B)，以及上皮细胞-间充质转化活 性（图8C)的局部表达表明了空间图案化的分化。
[0112] 图8D显示在10X物镜下的yP-hESC集落3天活体成像拼图，其显示3天分化过 程中的细胞运动。图8E显示在3天活体成像窗口中沿着图1D上的集落的黄线进行的波动 曲线记录图分析。集落边缘附近的细胞在第2天显示随机细胞迀移，但是在第3天经历了 定向的集合性细胞运动。如通过活体成像所观察的，空间局部分化细胞（在干细胞集落的 边缘）经历协调的细胞运动后形成3维状结构图形（图8D)。协调的细胞运动轨迹可从分 化的干细胞的空间-时间图（波动曲线记录图）（图8E)中看出。
[0113] 发育毒性药物影响yP-hESC模型中中内胚层结构的物理形态学/位置
[0114] 图9显示已知发育毒素引起的几何形状的中内胚层结构图形变化。图9A显示药 物处理的yP-hESC集落的波动曲线记录图。在发育毒性药物处理（沙利度胺&VPA)下，集 合性细胞迀移的轨迹在第2-3天受到干扰，而非发育毒性药物处理（青霉素G)下的集合性 细胞迀移未受影响。换句话说，已知的发育毒素，丙戊酸和沙利度胺，改变了细胞运动的轨 迹，而非发育毒素（青霉素G)没有（图9A)。图9B显示用/不用药物处理，中内胚层标记 物T在第3天的位置。当使用沙利度胺或VPA处理时，中内胚层图形（T+区域）的位置发 生错位，然而使用阴性对照药物青霉素G时保持不变。比例尺：100ym。换句话说，丙戊酸 和沙利度胺也改变了中内胚层结构图形的形态，但未处理的样品或用青霉素G处理的样品 没有（图9B)。
[0115] 发育毒性药物引起的剂量依赖性发育毒性应答
[0116] 图10显示提出的方法足够敏感以在不同浓度检测药物诱导作用的不同严重性。 在不同药物浓度通过的成像方法定量测量中内胚层结构图形的不同形态学特征变化。用主 成分分析（PCA)来分析这些在不同药物浓度的形态学特征。数据点代表各形态学特征；数 据点的颜色代表处理中使用的药物浓度。图10A-C显示当使用视黄酸（RA，>= 0. 0036yg/ ml)、沙利度胺（>=300yM)或VPA( >= 0. 8mM)处理时，yP-hESC集落内的中内胚层图 形的空间分布显著被干扰。图10D显示青霉素G药物处理即使浓度达到1000yg/ml，也未 显著干扰uP-hESC集落中的中内胚层图形的空间分布。对于已知的发育毒素，S卩（A)视黄 酸（RA)、（B)沙利度胺、（C)丙戊酸（VPA)，来自相同药物浓度的形态学特征分离成不同簇， (D)对于非发育毒素（青霉素G)，用不同药物浓度处理的形态学特征不能分离。
[0117] 数据收集方法：
[0118] 1.每种药物用3种不同浓度处理我们的yP-hESC集落并将样品于第3天与未处 理的普通样品一起固定。在Olympus荧光显微镜下获取样品的T免疫荧光图像。
[0119] 2.使用Matlab处理全部T荧光图像以提取代表中内胚层图形（图像中的T+阳性 区域）的空间分布的样品的全部相关形态学特征。
[0120] 主成分分析（PCA):
[0121] 在Matlab中对每种药物及未处理的对照的全部样品的全部所提取的特征进行 PCA，并将PCA结果绘图。
[0122] 通过其发育毒性作用进行药物分类
[0123] 图11显示提出的方法可以与用于成年和胚胎细胞的存活力测试组合，以通过其 发育毒性作用对药物进行正确分类。图11A显示RA的有效浓度（能显著干扰yP-hESC集 落中中内胚层图形空间位置的药物最低浓度）（ECKA)是~~0. 0036yg/ml，该浓度对hESC 细胞系J19或成年人皮肤成纤维细胞（aHDFs)无毒性。致畸药物在不影响胚胎和成年细胞 存活的浓度会改变中内胚层结构图形的形态（例如视黄酸（图11A))。因此RA是一种致畸 的发育毒性药物。
[0124]当导致结构图形改变的有效药物浓度与减少胚胎细胞存活力的药物浓度重叠时， 药物是胚胎毒性的（例如沙利度胺和丙戊酸（图11B-C))。图11B显示EC_WK是~300yM， 该浓度对aHDFs无毒但对H9细胞有毒（> 50 %存活）。因此沙利度胺是致畸和胚胎毒性 的发育毒性药物。图11C显示ECVPA是~0. 8yM，该浓度对aHDFs有轻度毒性但对H9细胞 具有很强毒性（~20%存活）。因此VPA是具有很强胚胎毒性的发育毒性药物（意味着对 hESCs具有很强毒性）。
[0125] 当在观测到成年和胚胎细胞的细胞存活力下降的药物浓度下，中内胚层结构图形 未受影响时，药物是非发育毒性（例如青霉素G(图11D))。图11D显示EC#<J^在lOOOyg/ ml(大多数发育毒性测试平台的最高测试浓度）以上。因此青霉素G是非发育毒性药物。
[0126] 本领域的技术人员将意识到，本文所描述的发明能容许不同于那些具体描述实例 的变体和修改。本发明包括所有这些变体和修改。本发明还包括在说明书中被提到或指出 的所有这些步骤、特征、配制物和化合物，单独地或全体地以及任意和全部的组合或任意两 个或多个步骤或特征的。
[0127] 本文中引用的每份文献、参考资料、专利申请或专利都以其整体通过引用而被明 确地合并于此，这意味着读者应当作为将其本文的一部分被来阅读和考虑。本文中引用的 文献、参考资料、专利申请或专利没有在本文中进行重复只是出于简明的原因。
[0128] 用于本文或任何通过引用并入本文的文件中所提及的任何产品的任何制造商的 指示、说明、产品说明书及产品页通过引用并入本文，并且在本发明的实践中可以被采用。
[0129] 本文描述的任何【具体实施方式】不限制本发明的范围。这些【具体实施方式】仅仅意在 例证目的。功能上等同的产品、配制物和方法明显地在如本文所描述的发明范围内。
[0130] 本文所描述的发明可以包括数值（例如尺寸、浓度等）的一个或多个范围。数值 范围将被理解成包括该范围在内的所有值，包括定义该范围的值和邻近该范围的值，其导 致与紧邻定义该范围边界值的那些值相同或基本相同的结果。
[0131] 除非上下文另有需要，贯穿本说明书的词语"包含（comprise)"或者各变型诸如 "包含（comprises) "或"包含（comprising) "，将被理解成暗示对所陈述的整数或整数集 合的包含而非对任何其他整数或整数集合的排除。还要注意的是，在本文公开的内容中并 且特别是在权利要求书和/或各段落中，诸如"包含（comprises) "、"包含（comprised) "、 "包含（comprising) "等的术语可以具有美国专利法中给予的含义；例如，它们可以意指 "包括（includes) "、"包括（included) "、"包括（including) "等；诸如"主要由...组成(consisting essentially of)"和"主要由...组成（consists essentially of)"的术 语具有美国专利法中给予的含义，例如，它们允许未被明确记载的要素，但排除在现有技术 中被发现的或者影响本发明的基本特征或新特征的要素。
[0132] 用于此处的所选术语的其他定义可以在本发明的【具体实施方式】部分中找到并且 始终可以应用。除非另外限定，本文所用的所有其他科技术语具有与本发明所属领域技术 人员通常理解相同的含义。
[0133] 参考文献
[0134]1. Petrini? J. ? Damus. K. and Johnston，R. B.，Jr. An overview of infant mortality and birth defects in the United States. Teratology 56,8-10 (1997) ?
[0135] 2. Heron? M. et al. Deaths ：Final data for 2006. Natl. Vital Stat. Rep. 57? 1-134(2009).
[0136] 3. Tan? K. H. et al. Birth defects in Singapore：1994-2000. Singapore Med. J. 46,545-552(2005).
[0137] 4. U. S. Environmental Protection Agency，E. Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. (1991).
[0138]5. Bantle，J. a.，Fort，DJ.，Rayburn，J. R.，DeYoung，D. J. and Bush，S. J. Further validation of FETAX Evaluation of the developmental toxicity of five known mammalian teratogens and non-teratogens. Drug. Chem. Toxicol. 13. 267-282(1990).
[0139] 6. Jelinek? R. ? Peterka. M