表达来自烟曲霉的葡糖淀粉酶的里氏木霉宿主细胞和其使用方法
【专利说明】表达来自烟曲霉的葡糖淀粉酶的里氏木霉宿主细胞和其使 用方法
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2012年12月11日提交的国际专利申请no.PCT/CN2012/086349 的优先权，并且其以引用方式整体并入本文。
[0003] 附件是包括SEQIDN0:1-14的序列表，其以引用方式整体并入本文。
技术领域
[0004] 本发明提供表达来自烟曲霉（Aspergillusfumigatus)的葡糖淀粉酶（AfGATR) 或其变体的里氏木霉（Trichodermareesei)宿主细胞，和其使用方法。
【背景技术】
[0005]淀粉由直链淀粉（15-30%重量/重量）和支链淀粉（70-85%重量/重量）的混 合物组成。直链淀粉由a-1，4_连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量（MW)为约60, 000 至约800, 000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有a-1，6分支点的支链聚合物；其MW 可能高达100, 〇〇〇, 〇〇〇。
[0006] 得自淀粉的、以浓缩右旋糖浆形式存在的糖目前通过酶催化法制备，所述方法涉 及：（1)用a-淀粉酶将固体淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度为约7-10的糊精，以 及（2)用葡糖淀粉酶（也称为淀粉葡糖苷酶或GA)将所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖 化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称 为异糖浆（isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可用微生物（如酵母）发酵 以产生商品，包括例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、 其他有机酸、其他氨基酸和其他生化物质。可同时进行发酵和糖化（即SSF工艺）来实现 更大的经济性和效率。
[0007] 葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4-a-葡糖水解酶，EC3. 2. 1. 3)是水解淀粉的外切碳水 化合物分解酶，其催化从淀粉或者相关低聚糖和多糖分子的非还原端去除连续的葡萄糖单 元。葡糖淀粉酶可以水解淀粉（例如，直链淀粉和支链淀粉）的直链和支链糖苷键。另一方 面，a-淀粉酶通过随机裂解内部的a-1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关的多糖。葡糖 淀粉酶已被用于各种不同的目的，包括淀粉糖化、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、 用于发酵工艺的原料的生产以及用于动物饲料中来增加可消化率。
[0008] 葡糖淀粉酶由细菌、真菌和植物的许多菌株产生。例如，葡糖淀粉酶由烟曲霉 菌株产生。Luo等人，（2008)/'Productionofacidproofrawstarch-digesting glucoamylasefromanewlyisolatedstrainofAspergillusfumigatusMS-09从 烟曲霉MS-09的新分离菌株产生耐酸生淀粉消化的葡糖淀粉酶"），Sci.Tech.FoodIndus. (《食品工业科技》），29 (5): 151-154;Sellars等人，（1976)/'Degradationofbarley byAspergillusfumigatusFres"（ "利用烟曲霉Fres使大麦降解"），Proc.Int. BiodegradationSymp.(《国际生物降解研讨会会刊》），第3版，S.J.Miles等人编辑，Appl. Sci.(《应用科学》），Barking,UK(英国巴金），第 635_43 页；Domingues等人，（l"3)，"Productionofamylasebysoilfungiandpartialbiochemicalcharacterization ofamylaseofaselectedstrain(AspergillusfumigatusFresenius) "（ 通 过所选菌株（烟曲霉）的淀粉酶的土壤真菌和部分生物化学表征来产生淀粉酶"）， Can.J.Microbiol.(《加拿大微生物学杂志》），39 (7) : 681-85;Cherry等人，（2004)， "ExtracellularglucoamylasefromtheisolateAspergillusfumigatus"（"来自分 离烟曲霉的细胞外葡糖淀粉酶"），PakistanJ.Biol.Sci.(《巴基斯坦生物科学杂志》）， 7(11) :1988-92。然而，烟曲霉对于人类和植物具高度过敏性和致病性。因此，对于在制造 人类消费产品的工业方法中使用的葡糖淀粉酶而言，烟曲霉并非可行的生产宿主。有必要 从合适的宿主产生烟曲霉葡糖淀粉酶。
【发明内容】
[0009] 在里氏木霉中表达的来自烟曲霉的葡糖淀粉酶（AfGATR)在高温和酸性pH下以较 长的时间催化糖化。提供了来自烟曲霉的已知葡糖淀粉酶（SEQIDN0:1和2)、编码核酸 以及表达所述多核苷酸的里氏木霉宿主细胞的例子。里氏木霉宿主细胞相比于天然表达 的AfGA烟曲霉以更高或至少相当的水平表达AfGATR。AfGATR(包括AfGAlTR和AfGA2TR) 在高温和低pH下表现出高活性，所以AfGATR在存在a-淀粉酶如白曲霉（Aspergillus kawachii)a-淀粉酶（AkAA)的情况下可有效地应用于糖化工艺中。与在烟曲霉中表达的 黑曲霉（Aspergillusniger)葡糖淀粉酶（AnGA)或天然AfGA催化的糖化产物相比，AfGATR 有利地催化淀粉糖化为显著富集DPI(即，葡萄糖）的低聚糖组合物。AfGATR如AfGAlTR、 AfGA2TR或其变体能够以比AnGA和天然表达的AfGA低的剂量使用，以生成相当水平的葡 萄糖。AfGATR或其变体可以与源自植物（例如，谷物和谷粒）的酶结合使用。AfGATR或 其变体还可以与宿主细胞分泌或宿主细胞内源的酶结合使用。例如，AfGATR或其变体可被 添加到糖化反应或SSF工艺，在所述工艺期间一种或多种淀粉酶、其他的葡糖淀粉酶、蛋白 酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其他酶由生产宿主分泌。AfGATR或其变体 也可以与内源性非分泌型生产宿主酶组合在一起工作。在另一个例子中，AfGATR或其变体 可在糖化或SSF期间由生产宿主细胞与其他酶一起分泌。AfGATR葡糖淀粉酶或其变体可用 于如下工艺中，所述工艺涉及将淀粉直接水解为糖浆和/或生化物质（例如，醇类、有机酸、 氨基酸、其他生化物质和生物材料），其中反应温度低于底物的糊化温度。AfGATR或其变体 可在糖化或SSF期间由里氏木霉宿主细胞与其他酶一起分泌。
[0010] 因此，提供了一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或 其变体与SEQIDN0:12或13具有至少80%序列同一性，其中所述里氏木霉宿主细胞相比 于烟曲霉宿主细胞以相当水平表达AfGATR或其变体，所述烟曲霉宿主细胞在相同条件下 表达与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体。
[0011] 还提供了一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或 其变体与SEQIDN0:12或13具有至少80%序列同一性，其中AfGATR或其变体相比于 与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述 AfGA或其变体在烟曲霉宿主细胞中表达。
[0012] 还提供了一种用于生产重组AfGATR或其变体的方法，其包括：（a)提供表达重组 AfGATR或其变体的里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQIDN0:12或13具有 至少80%序列同一性；(b)在允许产生所述重组AfGATR或其变体的条件下培养所述宿主细 胞；和（c)分离所述重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体相比于与AfGATR或 其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变 体在烟曲霉宿主细胞中表达。
[0013] 还提供了一种由所公开的宿主细胞产生的重组AfGATR或其变体。所述重组 AfGATR或其变体在74°C下在pH5.0下10分钟内可具有至少70%活性。所述重组AfGATR 或其变体可为AfGAlTR。所述AfGAlTR在55°C-74°C的温度范围内在pH5. 0下10分钟内 可具有至少70 %活性。所述AfGAlTR可具有约68°C的最佳温度。所述重组AfGATR或其变 体也可为AfGA2TR。所述AfGA2TR在61°C-74°C的温度范围内在pH5. 0下10分钟内可具 有至少70%活性。所述AfGA2TR可具有约69°C的最佳温度。所述重组AfGATR或其变体可 包含与SEQIDN0:12具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述 重组AfGATR或其变体可包含SEQIDN0:12。所述重组AfGATR或其变体还可由与SEQID NO: 13具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。所述重组AfGATR 或其变体可由SEQIDNO: 12组成。所述重组AfGATR或其变体还可包含与SEQIDNO: 13 具有至少90%、95%或99 %氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述重组AfGATR或其变体 可包含SEQIDN0:13。所述重组AfGATR或其变体还可由与SEQIDN0:13具有至少90%、 95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。所述重组AfGATR或其变体可由SEQID NO: 13组成。
[0014] 还提供了一种糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物的方法，其中所 述方法包括：（i)使淀粉组合物与根据权利要求4-15中任一项所述的分离的AfGATR或其 变体接触；和（ii)糖化所述淀粉组合物以产生所述葡萄糖组合物；其中所述AfGAlTR或其 变体催化所述包含淀粉的组合物向包含葡萄糖的组合物的糖化。与由AnGA在相同条件下 制备的包含DPI的第二组合物相比，所述包含葡萄糖的组合物可富含DPI。与由野生型AfGA 在相同条件下制备的包含DPI的第二组合物相比，所述包含葡萄糖的组合物还可富含DPI。 所述AfGATR或其变体可为AfGATR2,并且所述包含葡萄糖的组合物与由AfGAlTR在相同 条件下制备的包含DPI的第二组合物相比可富含DPI。所述AfGAlTR或其变体的剂量可为 AnGA剂量的约40% -50%，以在相同条件下产生相同的DPI产率。
[0015] 此外提供，所述包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。糖化可在 约30°C至约65°C的温度范围内进行。所述温度范围可为47°C_60°C。糖化可在pH2. 0-pH 6.0的pH范围内进行。所述pH范围可为pH3. 5_pH5. 5。所述pH范围还可为pH4. 0_pH 5. 0〇
[0016] 此外提供，糖化方法还可包括使淀粉组合物与a-淀粉酶接触。所述a-淀粉酶 可为AkAA。所述糖化方法还可包括使淀粉组合物与支链淀粉酶接触。
[0017] 此外提供，所述糖化方法还可包括使所述葡萄糖组合物发酵以产生发酵最终 (EOF)产物。该发酵还可以是同时糖化和发酵（SSF)反应。该发酵可在pH2-8下并且 在25°C-70°C的温度范围内进行24-70小时。EOF产物可包含乙醇。该EOF产物可包含 8%-18% (v/v)的乙醇。所述方法还可包括使麦芽浆和/或麦芽汁与支链淀粉酶、a-淀 粉酶和AfGAlTR或其变体接触。所述方法还可包括：(a)制备麦芽浆；(b)过滤所述麦芽浆 以获得麦芽汁，和（C)使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料，其中支链淀粉酶、a-淀粉酶和AfGAlTR或其变体被添加至：（i)步骤（a)的麦芽浆和/或（ii)步骤（b)的麦芽汁和/或 (iii)步骤（c)的发酵麦芽汁。该EOF产物可包含代谢物。该代谢物可以是柠檬酸、乳酸、 琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡