2 组成。
16. 根据权利要求4-5和9-11中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR 或其变体包含与SEQ ID NO: 13具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序 列。
17. 根据权利要求16所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体包含SEQ ID N0:13〇
18. 根据权利要求4-5和9-11中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR 或其变体由与SEQ ID NO: 13具有至少80%、90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸 序列组成。
19. 根据权利要求18所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGAlTR或其变体由SEQ ID NO: 13 组成。
20. -种糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物的方法，其中所述方法包 括： (i) 使淀粉组合物与根据权利要求4-19中任一项所述的分离的AfGATR或其变体接触； 和 (ii) 糖化所述淀粉组合物以产生所述葡萄糖组合物；其中所述AfGAlTR或其变体催化 所述包含淀粉的组合物向包含葡萄糖的组合物的糖化。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述包含葡萄糖的组合物与包含DPl的第二组 合物相比富含DPl，所述包含DPl的第二组合物由AnGA在所述相同条件下糖化24小时后产 生。
22. 根据权利要求20所述的方法，其中所述包含葡萄糖的组合物与包含DPl的第二组 合物相比富含DPl，所述包含DPl的第二组合物由野生型AfGA在所述相同条件下产生。
23. 根据权利要求20所述的方法，其中所述AfGATR或其变体为AfGATR2及其中所述 包含葡萄糖的组合物与包含DPl的第二组合物相比富含DPl，所述包含DPl的第二组合物由 Af GA ITR在所述相同条件下产生。
24. 根据权利要求20所述的方法，其中所述AfGAlTR或其变体的剂量为AnGA剂量的约 40% -50%，以在相同条件下糖化24小时后产生相同的DPl产率。
25. 根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述包含淀粉的组合物包含液化 淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。
26. 根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中糖化在约30°C至约65°C的温度范 围内进行。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述温度范围为47°C至60°C。
28. 根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中糖化在pH 2. 0至pH6. 0的pH范围 内进行。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述pH范围为pH 3. 5至pH5. 5。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述pH范围为pH 4. 0至pH5. 0。
31. 根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使淀粉组合物与 a -淀粉酶接触。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述a -淀粉酶为AkAA。
33. 根据权利要求20-32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使淀粉组合物与 支链淀粉酶接触。
34. 根据权利要求20-33中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述葡萄糖组合物 发酵以产生发酵最终（EOF)产物。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述发酵是同时糖化和发酵（SSF)反应。
36. 根据权利要求34或35所述的方法，其中所述发酵在pH 2至8下并且在25°C至 70°C的温度范围内进行24至70小时。
37. 根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含乙醇。
38. 根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含8 %至18% (v/ v)的乙醇。
39. 根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使麦芽浆和/或麦 芽汁与支链淀粉酶、a -淀粉酶和所述AfGATR或其变体接触。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述方法还包括： (a) 制备麦芽浆； (b) 过滤所述麦芽浆以获得麦芽汁；和 (c) 使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料， 其中所述支链淀粉酶、所述a -淀粉酶和所述AfGATR或其变体被添加至： (i) 步骤（a)的麦芽浆和/或 (ii) 步骤（b)的麦芽汁和/或 (iii) 步骤（c)的麦芽汁。
41. 根据权利要求34-40中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含代谢物。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述代谢物是柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一 钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸S-内酯、异抗坏血酸钠、D-3脂肪酸、 丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或异戊二烯。
43. 根据权利要求20-42中任一项所述的方法，还包括向所述淀粉组合物添加另外的 葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、蛋白酶、支 链淀粉酶、0 _淀粉酶、另外的a -淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、 海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、a-葡糖苷酶、e-葡糖苷酶、裂解 酶、水解酶或者它们的组合。
44. 根据权利要求20-43中任一项所述的方法，其包括以0. 1至2葡糖淀粉酶单位 (GAU) /g干固形物的剂量添加所述AfGATR或其变体。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述AfGATR或其变体以约49. 5 y g蛋白质/g 固形物的剂量添加。
46. 根据权利要求20-45中任一项所述的方法，其中所述分离的AfGATR或其变体由所 述里氏木霉宿主细胞分泌。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌a -淀粉酶。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌支链淀粉酶。
49. 根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中使所述包含淀粉的组合物与所述 宿主细胞接触。
50. -种包含葡萄糖的组合物，其根据权利要求20-49中任一项所述的方法生产。
51. -种液化淀粉，其根据权利要求34-49中任一项所述的方法生产。
52. -种发酵饮料，其根据权利要求20-49中任一项所述的方法生产。
53. -种用于糖化包含淀粉的组合物的组合物，其包含根据权利要求4-19中任一项所 述的分离的AfGATR或其变体。
54. 根据权利要求53所述的组合物，其中所述组合物是培养的细胞材料。
55. 根据权利要求53或54所述的组合物，其中所述组合物包含a -淀粉酶。
56. 根据权利要求53-55中任一项所述的组合物，其中所述AfGATR或其变体是经纯化 的。
57. 根据权利要求53-56中任一项所述的组合物，其中所述AfGATR或其变体是由宿主 细胞分泌。
58. -种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其用于生产包 含葡萄糖的组合物。
59. -种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其用于生产液 化淀粉。
60. -种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其用于生产发 酵饮料。
61. 根据权利要求34-42中任一项所述的方法、根据权利要求52所述的发酵饮料或根 据权利要求60所述的用途，其中所述发酵饮料或发酵最终产物选自： i) 啤酒，所述啤酒选自：全麦芽啤酒、根据"纯净法"酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤 酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精 啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽 酒；和 ii) 选自如下的谷物或麦芽饮料：水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。
62. -种生产食品组合物的方法，包括将以下物质组合 (i) 一种或多种食品成分，和 (ii) 根据权利要求4-19所述的分离的AfGATR或其变体， 其中所述支链淀粉酶和所述分离的AfGATR或其变体催化所述食品成分中存在的淀粉 组分的水解而产生葡萄糖。
63. 根据权利要求62所述的方法，其中所述食品组合物选自食品、烘焙组合物、食品添 加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。
64. 根据权利要求62或63中任一项所述的方法，并且其中所述一种或多种食品成分包 含烘焙成分或添加剂。
65. 根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自：面 粉；抗变陈淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麦芽a-淀粉酶或其具有生麦芽a-淀粉酶活性的变 体、同源物或突变体；烘培食品用木聚糖酶（EC 3. 2. 1. 8);和脂肪酶。
66. 根据权利要求65所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自： (i) 来自嗜热脂肪芽孢杆菌的生麦芽糖a-淀粉酶， (ii) 来自芽孢杆菌属、曲霉属、嗜热真菌属或木霉属的烘焙食品用木聚糖酶， (iii) 来自异孢镰孢菌的糖脂酶。
67. 根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中所述食品组合物包含面团或面团 产品，优选经加工的面团产品。
68. 根据权利要求62-67中任一项所述的方法，包括烘焙所述食品组合物以生产烘焙 产品。
69. 根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中所述方法还包括： (i) 提供淀粉介质； (ii) 向所述淀粉介质添加所述支链淀粉酶和所述AfGATR或其变体；和 (iii) 在步骤（b)期间或之后向所述淀粉介质加热以生产烘焙产品。
70. -种用于生产食品组合物的组合物，其包含根据权利要求4-19中任一项所述的 AfGATR或其变体。
71. -种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其用于制备食品 组合物。
72. 根据权利要求71所述的用途，其中所述食品组合物包含面团或面团产品，优选经 加工的面团产品。
73. 根据权利要求71或72所述的用途，其中所述食品组合物为烘焙组合物。
74. -种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其在面团产品中 用于延缓或减轻所述面团产品变陈，优选地延缓或减轻其不利回生。
【专利摘要】本发明提供了在里氏木霉宿主细胞中表达的来自烟曲霉的真菌葡糖淀粉酶(AfGATR)。里氏木霉宿主细胞相比于天然表达的AfGA烟曲霉以更高或至少相当的水平表达AfGATR。AfGATR(包括AfGA1TR和AfGA2TR)在高温和低pH下表现出高活性，所以AfGATR在存在α-淀粉酶如白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶(AkAA)的情况下可有效地应用于糖化工艺中。与在烟曲霉中表达的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(AnGA)或天然AfGA催化的糖化产物相比，AfGATR有利地催化淀粉糖化为显著富集DP1(即，葡萄糖)的低聚糖组合物。AfGATR如AfGA1TR、AfGA2TR或其变体能够以比AnGA和天然表达的AfGA低的剂量使用，以生成相当水平的葡萄糖。
【IPC分类】C12P19-14, C12N1-14, C12N9-34, C12N15-80
【公开号】CN104870631
【申请号】CN201380064450
【发明人】葛晶, L·华, S·H·李, J·李, J·K·舍蒂, Z·唐, B·张, K·钟
【申请人】丹尼斯科美国公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2013年11月21日