149] 关于多肽的术语"变体"是指因其包括一个或多个天然存在的或人为制造的氨基 酸置换、插入或缺失而不同于指定的野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽。类似地，关 于多核苷酸的术语"变体"是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或 参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份从上下文来看将是 显而易见的。
[0150] 就本发明的酶如葡糖淀粉酶而言，"活性"是指酶活性，其可如本文所述进行测量。
[0151] 当用于对象细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语"重组"指该对象已从其天然状态经 过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然（非重组）形式的细胞中存在的基因，或者以 不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。重组核酸与天然序列相差一个或多个核 苷酸和/或可操作地连接至异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白可与天然 序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码AfGAl、AfGA2或其变体的核 酸的载体是重组载体。
[0152] 术语"回收的"、"分离的"和"分开的"是指这样的化合物、蛋白质（多肽）、细胞、 核酸、氨基酸或其他指定的物质或组分，其从如在自然界中存在的那样与其天然相关的至 少一种其他物质或组分中移除，例如从重组宿主细胞中分离的AfGATR。"分离的"AfGATR 或其变体包括但不限于：包含在异源宿主细胞（即，非烟曲霉的宿主细胞）中表达的分泌 AfGATR的培养发酵液。
[0153] 如本文所用，术语"纯化的"是指处于相对纯的状态的物质（例如，分离的多肽或 多核苷酸），所述相对纯的状态如纯度至少约90%、纯度至少约95%、纯度至少约98 %或纯 度甚至至少约99%。
[0154] 关于酶的术语"热稳定的"和"热稳定性"是指酶在暴露于高温后保持活性的能力。 酶（例如淀粉酶）的热稳定性可通过其Tm测量，在此期间酶活性在限定的条件下损失一半。 Tm可通过测量暴露于（即，经受）高温后残余的葡糖淀粉酶活性来计算。
[0155] 关于酶的"pH范围"是指酶显示出催化活性的pH值范围。
[0156] 如本文所用，关于酶的术语"pH稳定的"和"pH稳定性"涉及在预定的时间段（如， 15分钟、30分钟和1小时）内、酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。
[0157] 如本文所用，术语"氨基酸序列"与术语"多肽"、"蛋白质"和"肽"是同义词，并且 可互换使用。当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为"酶"。使用氨基酸残基的常规单字 母或三字母代码，其中氨基酸序列是以标准的氨基至羧基末端取向（即N-C)给出。
[0158] 术语"核酸"涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单 链或双链的，而且可为化学修饰物。术语"核酸"与"多核苷酸"可互换使用。由于遗传密码 具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵 盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列以5'至3'取向给出。
[0159] 如本文所用，"杂交"是指在印迹杂交技术和PCR技术期间核酸的一条链与互补链 形成双链体、即与互补链发生碱基配对的过程。严格杂交条件由在如下条件下的杂交所例 示：65°C和 0?IXSSC(其中IXSSC= 0? 15MNaCl，0. 015M柠檬酸三钠，pH7. 0)。杂交的双 链核酸通过解链温度（TJ表征，在解链温度下一半杂交的核酸不与互补链配对。双链体内 的错配核苷酸降低Tm。编码变体葡糖淀粉酶的核酸较SEQIDN0:8与其相同互补链的核苷 酸之间形成的双链，可具有降低1°C_3°C或更多的Tm。
[0160] 如本文所用，"合成的"分子通过体外化学合成或酶促合成而生成、而非由生物体 生成。
[0161] 如本文所用，关于细胞使用的术语"转化"、"稳定转化"和"转基因"意指含有整合 进其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然（例如，异源）核酸序列的 细胞。
[0162] 在将核酸序列插入细胞的语境中，术语"引入"意指本领域已知的"转染"、"转化" 或"转导"。
[0163] "宿主菌株"或"宿主细胞"为已将表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体（包 括编码所关注的多肽（如，AfGATR或其变体）的多核苷酸）引入其中的生物体。示例性的 宿主菌株是能够表达所关注的多肽和/或使糖发酵的微生物细胞（例如细菌、丝状真菌和 酵母，如里氏木霉）。术语"宿主细胞"包括由细胞产生的原生质体。
[0164] 关于多核苷酸或蛋白质的术语"异源"是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷 酸或蛋白质。
[0165] 关于多核苷酸或蛋白质的术语"内源"是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或 蛋白质。
[0166] 如本文所用，术语"表达"是指基于核酸序列生成多肽的过程。所述过程包括转录 和翻译二者。
[0167] "选择性标记"或"可选标记"是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于对携 带该基因的宿主细胞的选择。可选标记的例子包括但不限于抗微生物剂（例如潮霉素、博 来霉素或氯霉素）和/或赋予宿主细胞代谢益处（如营养益处）的基因。
[0168] "载体"是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包 括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等等。
[0169] "表达载体"是指包含编码所关注多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列可 操作地连接至能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括影 响转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序 列、增强子，和控制转录和翻译终止的序列。
[0170] 术语"可操作地连接"意指特定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关 系（包括但不限于并置）。例如，调控序列可操作地连接至编码序列，使得编码序列的表达 受调控序列的控制。
[0171] "信号序列"是连接至蛋白质的N端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质在细胞外 的分泌。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。
[0172] 如本文所用，"生物活性的"是指具有特定生物活性（例如酶活性）的序列。
[0173] 如本文所用，"样片"是其上施有污渍的一块材料，例如织物。所述材料可以是例如 由棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制成的织物。所述样片还可以是纸，例如滤纸或 硝化纤维素，或者是一块硬质材料，如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的， 但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、颜料、油或这些 化合物的混合物。
[0174] 如本文所用，"小样片"是自样片上用单孔打孔装置切下的部分，或者用定制的96 孔打孔装置（其中该多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配）切下的部分，或者是以其 他方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织物、纸、金属或其他合适的材料。小样片可以 在其被放入24孔、48孔或96孔微量滴定板孔之前或之后具有固着的污渍。"小样片"也可 以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样片可以是直径为5/8英寸或0. 25英寸的一 块施有污渍的织物。定制的打孔器被设计成同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中。 所述装置可以通过简单地向同一 96孔板多次上样，而允许向每孔递送不止一个样片。可以 设想将多孔打孔装置用于向任何格式的板（包括但不限于24孔、48孔和96孔板）同时递 送多个样片。在另一个可设想的方法中，脏的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷或另 一合适材料制成的、被污渍包覆的珠粒。然后将一个或多个包覆的珠粒置于含有合适缓冲 液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。
[0175] 如本文所用，"包含AfGATR或其变体的培养的细胞材料"或者类似的用语是指包含 AfGATR或其变体作为组分的细胞裂解液或上清液（包括培养基）。细胞材料可以来自出于 制备AfGATR或其变体的目的而在培养物中生长的异源宿主。
[0176] "序列同一性百分比"意指以默认参数用CLUSTALW算法比对时，变体具有至少一 定百分比的氨基酸残基与野生型AfGAl或AfGA2相同。参见Thompson等人，（1994)Nucleic AcidsRes.(《核酸研宄》），22:4673-4680。CLUSTALW算法的默认参数为：
【主权项】
1. 一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO: 12或13具有至少80%序列同一性，其中在相同条件下所述里氏木霉宿主细胞以 与烟曲霉宿主细胞相当的水平表达所述AfGATR或变体，所述烟曲霉宿主细胞表达与所述 AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体。
2. -种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO: 12或13具有至少80%序列同一性，其中所述AfGATR或其变体相比于与AfGATR或 其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变 体在烟曲霉宿主细胞中表达。
3. -种用于产生重组AfGATR或其变体的方法，其包括： (a) 提供表达重组AfGATR或其变体的里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO: 12或13具有至少80%序列同一性； (b) 在允许所述重组AfGATR或其变体产生的条件下培养所述宿主细胞；并且 其中所述AfGATR或其变体相比于与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或 其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变体在烟曲霉宿主细胞中表达。
4. 一种重组AfGATR或其变体，其由权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞、或者根 据权利要求3所述的方法产生。
5. 根据权利要求4所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体在74°C下 在pH 5. 0下在10分钟内具有至少70 %活性。
6. 根据权利要求5所述的重组Af GATR或其变体，其中所述Af GATR或其变体为Af GA ITR 或其变体。
7. 根据权利要求6所述的重组AfGAlTR或其变体，其中所述AfGAlTR或其变体在55°C 至74°C的温度范围内在pH 5.0下在10分钟内具有至少70%活性。
8. 根据权利要求7所述的重组AfGAlTR或其变体，其中所述AfGATR或其变体具有约 68 °C的最佳温度。
9. 根据权利要求5所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体为AfGA2TR 或其变体。 1 〇.根据权利要求9所述的重组AfGA2TR或其变体，其中所述AfGA2TR或其变体在61 °C 至74°C的温度范围内在pH 5.0下在10分钟内具有至少70%活性。
11. 根据权利要求10所述的重组AfGA2TR或其变体，其中所述AfGA2TR或其变体具有 约69 °C的最佳温度。
12. 根据权利要求4-8中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变 体包含与SEQ ID NO: 12具有至少90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
13. 根据权利要求12所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体包含SEQ ID N0:12〇
14. 根据权利要求4-8中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变 体由与SEQ ID NO: 12具有至少80%、90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列组 成。
15. 根据权利要求14所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGAlTR或其变体由SEQ ID NO: 1