063] 〇3天而不是小鼠EST的7/10天。
[0064] 鲁测量分化模式的干扰而不是难以确定基准的分化水平变化。
[0065] 鲁通过测量分化模式的干扰，我们能定量获取非对称比例的变化，基于此可以进 行清晰的药物分类。然而，在目前测量hESC分化水平变化的模型中，在相同条件下，甚至属 于相同谱系的不同基因的表达变化可能会彼此大不一样。
[0066] 鲁区分非特异性细胞毒性和谱系定向分化的干扰。
[0067]〇我们的技术产生hESC分化图案并将测量这些形态学图案的干扰作为发育毒性 试验的测试读数。因为我们不测量细胞存活力，所以我们的测量不会与一般细胞毒性混淆， 其还影响细胞存活力。
[0068] ?兼容高通量和高含量成像分析系统。
[0069] 〇例如，我们能让我们的模型适用于可更简单和更少耗时地进行基质涂覆的96 孔板模式。在96孔板中接种hESC后，包括日常的培养基更换和免疫荧光染色在内的所 有随后的样品制备过程可使用JANUSTM自动液体处理系统（PerkinElmer)(由新加坡 BioLaboratories定制）自动化操作。此外，可使用Cellomics?ArrayScan?VTIHCS Reader (Thermo Scientific)获取图像以显著改善成像速度。最后，对于数据分析，我们可 以只修饰程序使得能够在MATLAB软件中做连续非对称比例计算。
[0070] 除了使用机械胁迫控制空间分化，我们也能直接图案化生长因子来诱导局部分 化，形成生长因子梯度而非空间梯度，其也能应用于发育毒性测试。在这个实例中，微图案 化是通过改变培养基上的中内胚层诱导培养基含量实施的。使用多步微图案化或微流体的 生长因子图案化可能更难以处理但是仍能实现。 实施例
[0071] 材料和方法
[0072] 细胞图案化
[0073] 为了产生机械胁迫梯度，使用AutoCAD软件设计了圆形或正方形的具有两种不同 尺寸（785000ym2或196250ym2)的Matrigel基质。然后制作聚二甲基硅氧烷（PDMS)模 板，所述制作通过使用激光切割机（UniversalLaserSystem)在一张127ym厚的PDMS薄 片（SpecialtySiliconeProductsInc.)上切割设计形状的图案并将其与激光切割的2mm 厚的PDMS衬垫结合进行。为了细胞图案化，通过加入200y1 70%乙醇将所述PDMS模板首 先密封入60mm培养皿中并在组织培养箱（hood)中干燥，然后通过与Matrigel?溶液温育 至少1小时涂覆Matrigel?(BDBiosciences)基质（图1)。此后以400万细胞/ml的密 度接种细胞。，温育1小时以使细胞附着之后，移去模板和多余的未附着的细胞。然后使用 0. 5%普郎尼克酸（pluronicacid)钝化表面10分钟，随后清洗3次。得到的图案化hESC 在mTesRl维持培养基（StemCellTechnologies)中温育过夜以稳定化，第二天开始中内胚 层诱导。
[0074] 中内胚层诱导
[0075] 用中内胚层诱导培养基诱导图案化的hESC集落分化，所述培养基是包含100ng/ ml激活素，25ng/mlBMP4和10ng/mlFGF2的基础无血清的APELTM培养基（STEMdiff?， StemCellTechnologies)。为了发育毒性测试，所述图案化的hESC集落与测试化学品一起 在中内胚层诱导培养基中培养。所述诱导持续3天，每天更换一半培养基，用/不用所述测 试化合物。
[0076] 免疫荧光染色、成像和数据分析
[0077] 在分化第3天固定样品。进行免疫荧光染色检测早期中内胚层标记物Brachyury 的表达分布。使用Olympus荧光显微镜在10X物镜下获取图像，并使用MATLAB程序计算非 对称比例（图5)。
[0078] 结果
[0079] 体外形成的空间非对称中内胚层分化图案
[0080] 在中内胚层诱导培养基中培养3天后，集落中的中内胚层的空间位置与集落的几 何形状一致，形成"圆环样"结构（图2和图3)。换句话说，分化3天后，形成了与hESC集 落的形状一致的几何形状的中内胚层结构。这种"圆环样"的结构具有独特的3维结构， Brachyury阳性细胞位于细胞薄片的顶层，一种"管样"结构形成于闪亮的"圆环"下方。这 种现象表明我们的系统中确实发生了局部细胞分化和形态发生移动，其在人胚胎发生中也 是并发的且不可避免的。
[0081] 致畸剂的空间非对称图案干扰
[0082] 使用这种模型测试三种已知的致畸剂（0.ImM丙戊酸（VPA)、0.05ug/ml5-氟尿嘧 啶（5-FU)和0. 8mM沙利度胺）。将中内胚层诱导培养基与药物一起加入我们的模型中，并 温育3天，然后将所述样品固定以进行Brachyury的免疫荧光染色。每天用所述药物更换 一半的培养基。仅在不含任何药物的中内胚层诱导培养基中培养的未处理对照也同样处 理。结果显示全部三种药物可以干扰原始非对称分化图案，即破坏"圆环"的形成（图4)。 为了测量这种干扰，我们以表示"环"区域与"非环"区域平均亮度比的非对称比例作为参 数以评价经过或未经过药物处理的非对称图案（图5)。结果显示，对于未处理的对照，平均 非对称比例大约2. 5-3. 5(图6)。当使用致畸剂处理时，非对称比例值因发育毒性作用而 显著下降。对于0. 05ug/ml5-FU，非对称比例下降了 46. 7%，从3降至1.6;0.ImM丙戊酸 和0. 8mM沙利度胺的不对称比例下降了~70%，从3降至~0. 9。这些结果意味着我们的 模型对不同致畸剂的处理相当敏感（图6)，其作用可定量测量并用于药物的分类和评分。
[0083] 几何形状的模板
[0084] 制备不同几何形状（长方形、圆形、半圆形、正方形）的模板以确定PS诱导是否影 响H9hESCs
[0085]1?使用60mm PS培养皿，
[0086] 2.将所述模板用乙醇密封于60mmPS培养皿上，
[0087] 3.在紫外光下使其干燥。
[0088] 制成两个平板。
[0089] 平板1:具有大的和小的形状的混合。
[0090] 平板2 :仅有大尺寸的形状。
[0091] 1 ?加热mTeSR1、accutase和DMEM/F12，
[0092] 2?用10ymROCKi补充3mlTeSRl(每份培养基加入5mM储存液2y1)。
[0093] 3.移去分化的区域，
[0094] 4.用DMEM/F12清洗培养物一次，
[0095] 5?每个60mm培养皿加入1mlaccutase并在37°C温育5-10分钟，
[0096] 6.轻轻研磨将集落破碎成单个细胞，
[0097] 7.将细胞转移至15ml试管，
[0098] 8.每1mlaccutase用至少5ml的DMEM/F12冲洗培养皿，收集培养基至15ml试管 中，
[0099] 9?将细胞在lOOOrpm离心3-5分钟，
[0100] 10.移去细胞并且在mTeSR 1中重悬，每个模板用1. 5ml补充的mTeSRl(对于2X 模板使用3X6孔），
[0101] 11.抽取细胞悬液，使用DMEM/F12清洗一次，
[0102] 12.加入3mlDMEM/F12至模板周边区域。使用镊子轻轻移去模板。除去DMEM/ F12，
[0103] 13?加入 3mlAPEL培养基 +lng/ml激活素A、25ng/mlBMP4 和 10ng/mlFGF2，
[0104] 14.两天后更换一半体积的培养基（1. 5ml)，
[0105] 15?固定并进行免疫染色。
[0106] 免疫染代
[0107] 样品在3. 7%多聚甲醛中固定20分钟，用含0.5%TritonX-100的PBS渗透15 分钟。在封闭缓冲液（含2%BSA和0? 1 %TritonX-100的TBS缓冲液）中于4°C温育 过夜后，与一抗（封闭缓冲液中5-lOyg/ml)于4°C温育过夜。所使用的一抗是山羊抗 Brachyury(10yg/ml，AF2085，R&Dsystem)。样品以 15 分钟间隔洗绦 5 次后加入Alexa Fluor染料缀合的二抗（1 : 1000,MolecularProbes)。室温温育1小时后，样品以15分 钟间隔洗绦5次并用Hoechst33342(10yg/ml，MolecularProbes)复染5分钟。此后，样 品用PBS清洗 3 次后使用Fluorsave?(Calbiochem)固定（mount)。
[0108] 图7显示了由微图案化的不同hESC细胞系形成的几何形状的中内胚层结构的图 像。微图案化为不同形状和尺寸的两种hESC系（H9和H1) 3天的中内胚层分化后产生了几 何形状中内胚层结构。图7A显示分化3天后的微图案化的H9hESCs，图7B显示分化3天后 的微图案化的HlhESCs。左幅显示相衬图像；右幅显示中内胚层标记物Brachury(T)的免 疫染色。比例尺= 200ym。
[0109] 空间图案化分化然后进行的形态发生性细胞运动
[0110] 图8显示几何形状的中内胚层结构化图形的特性。通过空间图案化分化然后进行 协调的形态发生性细胞运动形成了几何形状的中内胚层结构。图8A显示第1天至第3天 (D1-D3)微图案化的hESC(yP-hESC)集落的相位和荧光图像。中内胚层（T+)细胞第1天 空间图案化于集落边缘，然后在第3天展示举例集落边缘~150-200ym。通过（1)空间图 案化中内胚层分化然后进行（2)协调的细胞运动形成几何形状的结构图形（图8A)