该浓度对hESC细胞系H9或成年人皮肤成纤维细胞（aHDF)无毒性。因此RA 是一种致畸的发育毒性药物。（B) 是~300yM，该浓度对aHDF无毒但对H9细胞有毒 (> 50%存活）。因此沙利度胺是致畸和胚胎毒性的发育毒性药物。（C)ECVPA是~0. 8yM， 该浓度对aHDF有轻度毒性但对H9细胞具有很强毒性（20 %存活）。因此VPA是具有很强 胚胎毒性的发育毒性药物（意味着对hESC具有很强毒性）。（D)EC冑在1000yg/ml(大 多数发育毒性测试平台的最高测试浓度）以上。因此青霉素G是非发育毒性药物。
[0031] 发明详述
[0032] 一种体外测试发育毒性的方法，其描述为包括以下步骤：
[0033] 微图案化细胞外基质；
[0034] 在存在中内胚层诱导培养基的情况下，使胚胎干细胞在微图案化的细胞外基质上 生长以形成几何形状的中内胚层结构；以及
[0035] 在存在或不存在测试化合物的情况下，测试几何形状的中内胚层结构的变化，其 中，与不存在测试化合物的细胞相比，在存在测试化合物的情况下，（1)中内胚层细胞分化 的减少和/或（2)几何形状中的内胚层结构的形态学变化表明测试化合物是发育毒性剂。
[0036] 优选地，几何形状的中内胚层结构的形态学变化包括所述几何形状的中内胚层结 构形状和/或位置的变化。
[0037] 优选地，所述中内胚层诱导培养基包含激活素氨基酸、骨形态形成蛋白和成纤维 细胞生长因子2的混合物。然而，任何本领域已知的引发中内胚层分化的培养基均适用。所 述混合物可进一步包含血管内皮细胞生长因子。
[0038] 激活素可以是本领域已知的任何分离的、再生的或合成的激活素蛋白。在哺乳动 物中，描述了激活素的四种0亚基，称作激活素、激活素、激活素和激活素0E。 优选地，包含激活素1^二聚体的激活素A用于中内胚层诱导培养基。优选地，激活素0A 链具有SEQIDNO. 1的氨基酸序列：
[0039] MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEAVKKHILNMLHLK KRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSD LSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVDARKSTWHVFPV SSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEKEQSHRPFLMLQARQS EDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYR MRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
[0040] 成骨蛋白（BMP)是一组生长因子，也称为细胞因子或metabologen。有20种已知 的BMP。任何分离的、再生的或合成的BMP均适用。优选将BMP4用于所述中内胚层诱导培 养基。优选地，人BMP4具有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列：
[0041] MIPGNRMLMVVLLCQVLLGGASHASLIPETGKKKVAEIQGHAGGRRSGQSHELLRDFEATLLQMFGLRR RPQPSKSAVIPDYMRDLYRLQSGEEEEEQIHSTGLEYPERPASRANTVRSFHHEEHLENIPGTSENSAFRFLFNLSS IPENEVISSAELRLFREQVDQGPDWERGFHRINIYEVMKPPAEVVPGHLITRLLDTRLVHHNVTRWETFDVSPAVLR WTREKQPNYGLAIEVTHLHQTRTHQGQHVRISRSLPQGSGNWAQLRPLLVTFGHDGRGHALTRRRRAKRSPKHHSQR ARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSSIPKACCVPTE LSAISMLYLDEYDKVVLKNYQEMVVEGCGCR
[0042] 成纤维细胞生长因子（FGF)是一组生长因子。在人类中已知22种FGF，它们结构 上都相关，但是只有那些与肝素结合的FGF，例如FGF2将适用于所述中内胚层诱导培养基。 优选地，人FGF2具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列：
[0043] MVGVGGGDVEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSRAAGSPRTRGRR TEERPSGSRLGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALP EDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGR LLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
[0044] 在一个【具体实施方式】中，所述中内胚层诱导培养基进一步包含血管内皮细胞生长 因子（VEGF)。血管内皮细胞生长因子（VEGF)是由细胞产生的信号蛋白，其刺激脉管发生或 血管发生。广义的术语'VEGF'覆盖了本领域已知的大量蛋白。VEGF可用于中内胚层诱导 培养基。优选地，人VEGF具有SEQIDNO. 4的氨基酸序列：
[0045] MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEI EYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRG KGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNER TCRCDKPRR
[0046] 在一个【具体实施方式】中，微图案化是通过以下方式实现，制作聚二甲基硅氧烷 (PDMS)薄片模板，其具有在所述PDMS薄片中切割的多个几何形状，将所述PDMS模板密封入 培养容器，所述基质涂覆在培养容器中的PDMS模板上，这样当PDMS模板被移除时，只有在 所述多个几何形状中生长的细胞保留在培养容器中。优选地，所述培养容器是培养皿或96 孔板中的孔，然而任何盛放基质以使胚胎干细胞生长的容器均适用。
[0047] 在另一【具体实施方式】中，所述微图案化通过在基质上施用多个生长因子梯度来形 成。所述多个生长因子梯度可以多个几何形状的形式印于基质上，使用例如微接触印刷 (microcontactprinting)、微流体图案化、喷墨印刷（inkjetprinting)或任何其他本领 域已知的将图案印于基质上的方法进行。
[0048] 在一个【具体实施方式】中，所述多个几何形状具有相同的尺寸和形状。
[0049] 在另一个【具体实施方式】中，所述多个几何形状的尺寸不同或形状不同。
[0050] 所述多个几何形状可以是任何形状，例如圆形、正方形、半圆形、长方形或任意需 要的形状。
[0051] 优选地，所述培养基包含Engelbreth-Holm_Swarm(E；HS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝 胶状蛋白基质混合物。此已知为Matrigel?(BD Biosciences)或Cultrex BME?(Trevigen Inc)。其他能够支持胚胎细胞生长和分化的合适的培养基均适用，例如明胶、层粘连蛋白或 本领域已知的合成肽。
[0052] 所述测试方法可使用任何胚胎干细胞，但优选地，所述胚胎干细胞是人胚胎干细 胞（hESC)。在一个【具体实施方式】中，所述胚胎干细胞以400万细胞/ml的密度接种。
[0053] 优选地，中内胚层细胞分化测试是通过将针对中内胚层标记物的抗体和细胞温 育，并使细胞成像以检测标记物而实现的。
[0054] 优选地，与不存在测试化合物相比，在存在测试化合物的情况下，中内胚层细胞分 化在微图案化的外周变化表明所述测试化合物是发育毒性剂。
[0055] 我们提出的技术提供了在人干细胞中评价化学或药物诱导的发育毒性的新方法。 我们的技术概括了中内胚层分化的空间图案，其标志着原肠胚的局部区域最早期分化结 果。通过将人干细胞在具有特定几何结构的细胞外基质（ECM)岛上图案化，以对人胚胎干 细胞（hESC)集落施加机械性梯度来实现。集落几何边缘的细胞倾向于分化成中内胚层。微 图案化的hESC集落能产生对应于集落几何形状的中内胚层图案。这种分化图案在非细胞 毒性浓度时受已知致畸剂的干扰，例如丙戊酸和沙利度胺。在微图案化的人干细胞集落中 由于内源性机械胁迫导致的分化图案能通过成像方法定量，并且提供用于不同化学品和药 物发育毒性的定量测量方法。
[0056] 空间图案化的hESC分化由微图案化细胞集落中的内源性机械性梯度引起。
[0057]我们的技术能通过提供hESC实验数据以完善v-Embryo数据库补充ToxCast，其使 用计算模型预测肝脏和发育毒性。
[0058] 微图案化平台可用作研宄发育生物学的实验工具。
[0059] 我们的技术的优势包括以下内容：
[0060] 鲁技术用人胚胎或多潜能干细胞进行。
[0061] 〇我们提出的技术已显示用人ES细胞有效。
[0062] ?建立用于实验/药物测试的模型时间更短。
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