一种利用重组蛋白体外制备猪树突状细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用重组蛋白体外制备猪树突状细胞的方法，属于生物技术基因 工程领域。具体涉及一种高效制备猪白细胞介素4 (IL-4)和一种高效制备猪粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子（GM-CSF)重组蛋白的方法，以及利用这两种重组蛋白体外制备猪树突 状细胞的应用。 二、
【背景技术】
[0002] 树突状细胞是目前已知的体内功能最强的抗原呈递细胞（APC)，通过直接激活并 调控T淋巴细胞的免疫功能，对机体免疫反应发挥重要的调节作用，因此在免疫学研宄中 受到广泛的重视。
[0003] 树突状细胞可以来源于外周血和脐带血的单核细胞，也可以从骨髓液的前体细胞 分化而来，在不同的发育阶段具有不同的表型特征和生理功能。虽然树突状细胞在各种组 织中都有分布，但含量稀少，而进行表型特征、抗原摄取、抗原递呈和免疫排斥及免疫耐受 等基础研宄需要使用大量的树突状细胞。运用细胞因子体外大量诱导树突状细胞扩增是获 取研宄所需树突状细胞的最佳途径。IL-4和GM-CSF两种细胞因子在诱导血液单核细胞和 骨髓细胞成为未成熟的树突状细胞中发挥重要作用。利用IL-4和GM-CSF这两种细胞因子 联合刺激外周血单核细胞和骨髓液前体细胞，可以诱导培养获得未成熟的树突状细胞。
[0004] 进行猪树突状细胞相关的免疫学研宄，在动物医学领域意义重大，能为深入研宄 猪传染病的防止打下了基础；其次，目前对于树突状细胞的研宄主要集中在人和小鼠上，而 猪作为与人极为相似的哺乳动物，在解剖和基因上十分接近于人类，可作为一种更具优势 的大动物模型，是免疫学和病原微生物与宿主研宄的理想对象；此外，猪作为最理想的异种 器官移植供体动物，其树突状细胞在异种移植排斥反应及诱导免疫耐受中的作用越来越引 起人们的关注。
[0005] IL-4和GM-CSF具有种属特异性，本研宄提供了一种可以成功在真核细胞表达系 中分别获得猪的IL-4和GM-CSF重组蛋白的方法，并建立了一种在体外大量制备猪树突状 细胞的方法，为深入研宄猪的树突状细胞的各项功能以及与各种病原微生物作用等研宄奠 定基础。 三、
【发明内容】
[0006] 技术问题
[0007] 本发明提供了一种高效制备IL-4和一种高效制备GM-CSF重组蛋白的方法。可联 合应用上述两种重组蛋白刺激猪外周血单核细胞和骨髓液前体细胞，体外诱导培养获得猪 树突状细胞。这一生物学应用成本低，诱导细胞纯度高，具有良好应用前景和使用价值。
[0008] 技术方案
[0009] 本发明设计两种重组蛋白IL-4和GM-CSF，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO :1和 SEQ ID N0:2。以及两种监测目的重组蛋白表达情况的融合重组蛋白IL-4-G和GM-CSF-G， 其核苷酸序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。
[0010] A、从猪的总CDNA中扩增出扩增获得带有kozak序列、IL-4基因的CDS区和His6 标签（可串联绿色荧光蛋白基因）的序列片段，用in-fusion同源重组技术拼接到去除 AcGFPl基因的pLVX-AcGFPl-Nl载体的克隆位点中构建重组质粒；
[0011] B、从猪的总CDNA中扩增出扩增获得带有kozak序列、IL-4信号肽基因、GM-CSF成 熟肽基因、His6标签（可串联绿色荧光蛋白基因）的序列片段，用in-fusion同源重组技术 拼接到去除AcGFPl基因的pLVX-AcGFPl-Nl载体的克隆位点中构建重组质粒；
[0012] C、重组质粒转染HEK-293细胞进行重组蛋白的分泌表达。
[0013] 在一个实施例中，经验证GM-CSF使用自身的信号肽序列表达效率较低，提高表达 效率，两种目的蛋白IL-4和GM-CSF均使用IL-4的信号肽，具有可行性，再通过合适的表达 系统进行蛋白表达，整个过程涉及到基因分子克隆重组、蛋白表达技术，所用技术方法均合 乎该领域适合的技术方法。
[0014] 在一个实施例中，将目的蛋白IL-4和GM-CSF于绿色荧光蛋白ZsGreenl进行融合 表达作为对照，可对目的蛋白表达情况进行监督控制。
[0015] 在一个实施例中，由于GM-CSF和IL-4属于外源重组蛋白，选择HEK-293细胞作为 表达系统适合外源蛋白的表达，能提高重组蛋白的成功率和表达量，便于后续蛋白纯化。目 的蛋白带有His 6标签，可通过Ni磁珠进行纯化。
[0016] 本发明还提供一种体外制备猪树突状细胞的方法，其特征在于用上述两种重组蛋 白体外刺激诱导猪外周血单核细胞和骨髓液前体细胞，从而产生大量高纯度的猪树突状细 胞。
[0017] 本发明方法简单，易操作，成本低，诱导细胞纯度高，具有良好应用前景和使用价 值。
[0018] 有益效果
[0019] 本发明表达的两种重组蛋白可联合使用于体外制备猪骨髓源和外周血源树突状 细胞。经形态学观察、免疫荧光和流式细胞术鉴定、吞噬功能验证，为高纯度的未成熟树突 状细胞，可用于免疫学基础研宄。
[0020] 本发明表达的两种重组蛋白还可用作其他用途，如疫苗免疫增强剂。 四、【附图说明】
[0021] 图1 :构建的重组型表达质粒pLVX-S-IL-4示意图
[0022] 图2 :构建的重组型表达质粒pLVX-S-GM-CSF示意图
[0023] 图3 :构建的重组型表达质粒pLVX-S-IL-4-G示意图
[0024] 图4 :构建的重组型表达质粒pLVX-S-GM-CSF-G示意图
[0025] 图 5 :重组型表达质粒 pLVX-S-IL-4-G、pLVX-S-GM-CSF-G 瞬时转染 HEK-293 细胞 48h荧光蛋白表达情况
[0026] 图6 :利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞细胞形态学观察
[0027] 图7 :利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞免疫荧光观察
[0028] 图8 :流式细胞术鉴定利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞表型
[0029] 图9 :利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞吞噬功能验证
[0030] 图10 :利用重组蛋白制备的猪外周血源树突状细胞细胞形态学观察
[0031] 图11 :流式细胞术鉴定利用重组蛋白制备的猪外周血源树突状细胞表型 五、【具体实施方式】
【具体实施方式】
[0032]
[0033] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细 说明。本申请中的方法若无特殊说明，都是本领域常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：
[0034] E. coli JM109 购自 Takara 公司、质粒 pLVX-AcGFPl-Nl 和 pLVX-shRNA2 购自 Clontech公司、pCDNA3. 1购自Life Technologies公司；HEK-293细胞为南京农业大学动 物医学院组织胚胎学实验室提供。
[0035] 试剂：TRizol、反转录试剂盒购自Takara公司；Q5高保真酶购自NEB公司； Agarose Gel DNA Purification Kit，限制性内切酶购自Thermo公司；DNA纯化试剂盒、无 内毒素质粒提取试剂盒等均购自OMEGA公司；ClonExpress II重组克隆试剂盒购自Vazyme 公司；脂质体X_tremeGENE HP DNA购自Roche公司、培养基DMEM、胎牛血清购自Invitrogen 公司；猪源GM-CSF和猪源IL-4购自以色列ProSpec公司；PE标记小鼠抗猪⑶Ia单抗购 自Abcam公司；FITC标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗购自Lifespan公司；PE标记小鼠抗猪 SWC3a单抗购自BD公司；FITC标记的葡聚糖购自Sigma公司。其他试剂均为国产或进口分 析纯级。
[0036] 实施例1. pLVX-S-IL-4、pLVX-S-GM-CSF重组表达载体的构建
[0037] I. 1猪IL-4基因的克隆
[0038] 用TRizol法从猪的脾脏中提取总mRNA，以提取的总RNA为模板，用反转录试剂盒 合成cDNA。
[0039] 以上述cDNA为模板，根据NCBI中收录的猪的IL-4基因序列（NM_214123. 1)设计 引物