ST跟所需序列比对，同源性为100%。
[0083] 2. 3重组蛋白表达质粒pLVX-S-GM-CSF-G的构建
[0084] 设计一对引物，上引物5'端分别引入载体同源臂、BamHI酶切位点（下划线为酶 切位点），下游引物引入与ZsGreenl 5'末端的同源臂序列，引物序列如下：
[0085] P19 ：CGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGTGGCTGCAGAAC
[0086] P20 ：GTGCTTGGACTGGGCCATATGATGATGATGATGGTG
[0087] 以pLVX-S-GM-CSF为模板，用合成的P19、P20引物常规PCR克隆。反应结束后，在 1. 0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。将回收的DNA片 段与绿色焚光蛋白ZsGreenl基因片段通过in-fusion的方法连接到线性化的质粒pLVX-Nl 上，转化JM109感受态菌株。构建的质粒命名为pLVX-S-GM-CSF-G，经菌落PCR验证后，送去 测序。所获得的序列经BLAST跟所需序列比对，同源性为100%。
[0088] 实施例3.重组蛋白GM-CSF和IL-4在HEK-293细胞中瞬时表达
[0089] 转化大肠杆菌，将重组质粒 pLVX-S-GM-CSF、pLVX-S-IL-4、pLVX-S-GM-CSF-G、 pLVX-S-IL-4-G用无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质粒，具体操作步骤见说明书，提 取的质粒保存于_20°C，准备细胞转染。重组表达载体转染细胞可用本领域技术人员熟知 的常规方法进行。本发明采用脂质体法，分别在四个75mL细胞瓶中转染四种质粒。待细 胞铺满培养皿底的70% -80%时，改用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞2次，按 X-tremeGENE HP DNA转染试剂说明书，将四种重组质粒分别转染。细胞培养8h后弃去混 合液，用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞2次，用体积分数10%胎牛血清、链霉素 100ug/mL，青霉素 100U/mL 的 DMEM 培养基培养 60h。pLVX-S-GM-CSF-G 和 pLVX-S-IL-4-G 转染组作为对照，通过荧光显微镜观察，图5显示重组蛋白表达情况。
[0090] 实施例4.重组蛋白诱导猪骨髓源树突状细胞
[0091] 取健康仔猪股骨骨髓制成单细胞悬液，去除红细胞，加入完全培养基，台盼蓝染色 计数后以2 X IO5细胞/孔接种到24孔板，再加入含有的GM-CSF和IL-4两种重组蛋白的细 胞培养上清，以1 : 5-1 : 2560共10个稀释度加入到细胞中，设阴性对照（只含完全培养 基）和阳性对照（按照说明书添加商品化的细胞因子IL-4和GM-CSF)，37 °C，5 % CO2培养箱 中静置培养，48h全量换液，96h半量换液，6天后收集细胞。（1)显微镜下进行形态学观察： 图6结果显示诱导的细胞形成集落，具有典型树突状细胞的形态。（2)免疫荧光观察和流式 细胞术鉴定树突状细胞表型：取稀释度为1 : 5、1 : 20、1 : 80、1 : 320的重组蛋白处理 组，每组分成两份，第一份分别加入10 μ L PE标记小鼠抗猪⑶Ia单抗和10 μ L FITC标记小 鼠抗猪SLA-II-DR单抗；第二份分别加入10 μ L PE标记小鼠抗猪SWC3a单抗和10 μ L FITC 标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗，室温下避光孵育30min ;2500r/min，离心5min，用0.0 lM PBS 洗涤细胞2次，除去未吸附的荧光抗体；最后加入200uL的0.0 lM PBS重悬细胞，用少量细 胞制备细胞爬片在荧光显微镜下进行观察。图7结果显示⑶la、SLA-II、SWC3a分子均匀 分布在细胞膜上，且诱导产生的细胞具有典型树突结构。用IX IO4个细胞进行流式细胞术 检测。用未加荧光抗体（用0.0 lM PBS代替）的细胞作为细胞本底。图8结果显示CDla+/ SLA-II+的细胞为 46. 5% -67. 6%，SWC3a+/SLA-II+的细胞为 36. 6-51. 4%，说明通过本发 明技术得到的细胞为未成熟的猪树突状细胞。（3)细胞吞噬试验鉴定树突状细胞功能：取 稀释度为1 : 1〇、1 : 40、1 : 160、1 : 640、1 : 1280的重组蛋白处理组，每组分成两份， 第一份加入FITC标记的葡聚糖置于37°C避光作用30min，第二份加入FITC标记的葡聚糖 置于4°C避光作用30min ;作用完毕后，各组细胞加入0.0 lM PBS，2500r/min，离心5min，弃 上清，重复洗涤2次，除去未吸附的葡聚糖；用I X IO4个细胞进行流式细胞术检测。0.0 lM PBS替代FITC标记葡聚糖的细胞作为阴性对照。图9结果显示诱导产生的树突状细胞细胞 具有很强的吞噬葡聚糖颗粒的功能。
[0092] 实施例5.重组蛋白诱导猪外周血源树突状细胞
[0093] 取健康仔猪前腔静脉外周血，抗凝处理，用淋巴细胞分离液梯度离心获得单个核 细胞（PBMC)，去除红细胞，加入完全培养基，台盼蓝染色计数后以5X IO5细胞/孔接种到 6孔板，再加入含有的GM-CSF和IL-4重组蛋白的细胞培养上清，以1 : 40-1 : 160共3 个稀释度加入到细胞中，设阴性对照（只含完全培养基）和阳性对照（按照说明书添加商 品化的细胞因子IL-4和GM-CSF)，37°C，5 % CO2培养箱中培养48h，半量换液，再静置培养 48h，半量换液，再培养48h。（1)收集细胞进行形态学观察：图10结果显示诱导的细胞形 成集落，具有典型树突状细胞的形态。（2)流式细胞术鉴定树突状细胞表型：每个稀释度分 成两份，第一份分别加入10 μ L PE标记小鼠抗猪⑶Ia单抗和10 μ L FITC标记小鼠抗猪 SLA-II-DR单抗；第二份分别加入10 μ L PE标记小鼠抗猪SWC3a单抗和10 μ L FITC标记小 鼠抗猪SLA-II-DR单抗，室温下避光孵育30min ;2500r/min，离心5min，用0.0 lM PBS洗涤 细胞2次，除去未吸附的荧光抗体；最后加入200uL的0.0 lM PBS重悬细胞。用未加荧光抗 体（用0.0 lM PBS代替）的细胞作为细胞本底。用I X IO4个细胞进行流式细胞术检测，图 11 结果显示 CDla+/SLA-n+的细胞为 89. 3-92. l%，SWC3a+/SLA-n+的细胞为 44. 7-53. 1%。 说明通过本发明技术得到的细胞为未成熟的猪树突状细胞。
【主权项】
1. 一种高效制备猪IL-4重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：通过 PCR扩增获得带有kozak序列、IL-4基因的CDS区和His 6标签的序列，用in-fusion同源 重组技术拼接到去除AcGFPl基因的pLVX-AcGFPl-Nl载体的克隆位点中构建重组质粒；重 组质粒转染哺乳动物细胞进行重组蛋白的分泌表达。2. -种高效制备猪GM-CSF重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：通过 PCR扩增获得带有kozak序列、IL-4信号肽基因、GM-CSF成熟肽基因、His 6标签的序列片 段，用in-fusion同源重组技术拼接到去除AcGFPl基因的pLVX-AcGFPl-Nl载体的克隆位 点中构建重组质粒；重组质粒转染哺乳动物细胞进行重组蛋白的分泌表达。3. -种体外制备猪骨髓源树突状细胞的方法，其特征在于，所述树突状细胞是通过使 用权利要求1中所述的重组蛋白制备的。4. 一种体外制备猪外周血源树突状细胞的方法，其特征在于，所述树突状细胞是通过 使用权利要求1中所述的重组蛋白制备的。
【专利摘要】本发明涉及生物工程领域，分别公开了一种高效制备猪白细胞介素4(IL-4)和一种高效制备猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)重组蛋白的方法，以及利用这两种重组蛋白体外制备猪树突状细胞的应用。本发明方法简单，易操作，成本低，诱导细胞纯度高，具有良好应用前景和使用价值。
【IPC分类】C12N15/85, C12N5/0784, C07K14/54, C07K14/535
【公开号】CN104946685
【申请号】CN201510282338
【发明人】杨倩, 涂冲智, 朱立麒, 林 建
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月25日