，扩增猪IL-4的⑶S区序列。并在上游引物5'端引入载体同源臂、kozak序列、NheI 酶切位点（下划线为酶切位点），下游引物5'端分别引入His6#签序列，引物序列如下：
[0040] Pl：ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGGTCTCACCTCCCAAC
[0041] P2 ： TTAATGATGATGATGATGGTGACACTTTGAGTATTTCTCCTTCATAATC
[0042] PCR反应结束后，在1. 0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收 后，设计一对引物，并在下游引物5'端引入XhoI酶切位点（下划线为酶切位点）和载体同 源臂，引物序列如下：
[0043] P3 ：ACCCAAGCTGGCTAGCGCC
[0044] P4 ：GCCCTCTAGACTCGAGTTAATGATGATGATGATGGTGACAC
[0045] PCR反应结束后，在I. 0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收 后，连接到pcDNA3. 1载体上，构建的质粒命名为p-S-IL-4,经菌落PCR及酶切验证后，送去 测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪的 IL-4序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为100%。
[0046] L 2重组蛋白表达质粒pLVX-S-IL-4的构建
[0047] 设计一对引物，上游引物5'端引入载体同源臂、BamHI酶切位点（下划线为酶切 位点），下游引物5'端引入XbaI酶切位点（下划线为酶切位点），引物序列如下：
[0048] P5 ：CGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGGTCTCACCTC
[0049] P6 ：GGTAGAATTATCTAGATTAATGATGATGATGATGGTGACAC
[0050] 以PCR反应结束后，在1.0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收 后，连接到线性化的质粒pLVX-Nl (pLVX-AcGFPl-Nl去除绿色荧光蛋白AcGFPl基因并线性 化，末端为BamHI和XbaI酶切位点）上，构建的质粒命名为pLVX-S-IL-4,经菌落PCR及酶 切验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。 所克隆的猪的IL-4序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为99%，仅在85处有一 个碱基C突变成T，进一步分析表明这个点突变并不引起氨基酸的突变，和Genebank上已发 表的猪的IL-4序列表达相同的IL-4蛋白。
[0051] 1.3猪IL-4信号肽基因的克隆
[0052] 以上述pLVX-S-IL-4为模板，根据NCBI中收录的猪的IL-4基因序列 (ΝΜ_214123· 1)设计引物扩增猪IL-4的信号肽序列，引物序列如下：
[0053] P7 ：CGCGGGCCCGGGATCCGC
[0054] P8 ：GGGTGGGCGGGTGGGAGCTCCGTGGACGAAGTTGCTGGTAC
[0055] PCR反应结束后，在2. 0 %琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后 保存备用。
[0056] 1.4猪GM-CSF基因的克隆
[0057] 用TRizol法从猪的脾脏中提取总mRNA，以提取的总RNA为模板，用反转录试剂盒 合成cDNA。
[0058] 以上述cDNA为模板，根据NCBI中收录的猪的GM-CSF基因序列（NM_214118. 2)设 计引物，扩增猪的GM-CSF的CDS区序列。并在上游引物5'端引入载体同源臂、kozak序列、 NheI酶切位点（下划线为酶切位点），下游引物5'端分别引入His6#签序列，引物序列如 下：
[0059] P9 ：ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTC
[0060] P10 ： TTAATGATGATGATGATGGTGCTTTTTGACTGGCCCCCAGCAG
[0061] PCR反应结束后，在1.0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收 后，设计一对引物，并在下游引物5'端引入XhoI酶切位点（下划线为酶切位点）和载体同 源臂，引物序列如下：
[0062] PU ：ACCCAAGCTGGCTAGCGCC
[0063] P12 ：GCCCTCTAGACTCGAGTTAATGATGATGATGATGGTGCTTTTTG
[0064] PCR反应结束后，在I. 0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收 后，连接到pcDNA3. 1载体上，构建的质粒命名为p-S-GM-CSF，经菌落PCR及酶切验证后，送 去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪 的GM-CSF序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为100%。
[0065] 1. 5猪GM-CSF成熟肽基因的克隆
[0066] 以上述p-S-GM-CSF为模板，根据NCBI中收录的猪的GM-CSF基因序列 (NM_214118. 2)设计引物扩增猪GM-CSF的成熟肽序列，引物序列如下：
[0067] P13 ：GTACCAGCAACTTCGTCCACGGAGCTCCCACCCGCCCACCC
[0068] PI4：GGTAGAATTATCTAGATTAATGATGATGATGATGGTGCTTT
[0069] PCR反应结束后，在1.0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后 保存备用。
[0070] L 6重组蛋白表达质粒pLVX-S-GM-CSF的构建
[0071] 将已经回收的猪的IL-4信号肽基因片段和GM-CSF成熟肽基因片段通过 in-fusion的方法连接到线性化的质粒pLVX-Nl上，转化JM109感受态菌株。构建的质粒命 名为pLVX-S-GM-CSF，经菌落PCR验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与 Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪的IL-4信号肽和GM-CSF成熟肽序列与已经在 Genbank上发表的序列的同源性为100%。
[0072] 实施例 2. pLVX-S-IL-4-G、pLVX-S-GM-CSF-G 重组表达载体的构建
[0073] 2. I ZsGreenl 基因的克隆
[0074] 参照载体说明书设计一对扩增绿色荧光蛋白ZsGreenl基因的引物，在上游引物 引入与His 6标签3'末端的同源臂序列；在下游引物引入骨架载体5'末端的同源臂序列， 两序列之间引入XbaI酶切位点（下划线为酶切位点），引物序列如下：
[0075] P15 ：CACCATCATCATCATCATATGGCCCAGTCCAAGCAC
[0076] P16 ：GGTAGAATTATCTAGATCAGGGCAAGGCGGAGCC
[0077] 以pLVX-shRNA2质粒为模板，用合成的P15、P16引物常规PCR克隆，PCR反应结束 后，在1. 0%琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。
[0078] 2. 2重组蛋白表达质粒pLVX-S-IL-4-G的构建
[0079] 设计一对引物，上引物5'端分别引入载体同源臂、BamHI酶切位点（下划线为酶 切位点），下游引物引入与ZsGreenl 5'末端的同源臂序列，引物序列如下：
[0080] P17 ：CGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGGTCTCACCTC
[0081] P18 ：GTGCTTGGACTGGGCCATATGATGATGATGATGGTG
[0082] 以p-S-IL-4为模板，用合成的P17、P18引物常规PCR克隆。反应结束后，在1.0% 琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。将回收的DNA片段与绿 色焚光蛋白ZsGreenl基因片段通过in-fusion的方法连接到线性化的质粒pLVX-Nl上，转 化JM109感受态菌株。构建的质粒命名为pLVX-S-IL-4-G，经菌落PCR验证后，送去测序。 所获得的序列经BLA