不 同位点上设计T1端和T2端，设计了大量的探针，不停筛选试验。不同特异性探针的T1端 和T2端的长度都不是固定的。所以要设计T1端和T2端最佳的位置和长度。
[0017] 一种丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针，序列如下：
[0018] TGCGTCGCCG 八八 CGGCK^^ ACCGCTATCGTTAGATCAGTTGGACTCGATGTTGCTCCjGGATCATTGAT
[0019] 丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针的应用，包括利用所述的 Padlock探针制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒，或将Padlock探针结合 Macroaary杂交后进行检测等。
[0020] Padlock探针制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒，试剂盒的应用 过程包括：
[0021] PLP连接反应体系（10ul) :0? 2yLTaqDNA连接酶（40U/yL)，lyLlOXTaqDNA 连接酶Buffer，1yLPadlock探针（2ymol/L)，6. 8yL灭菌去离子水，1yL待测模板DNA。
[0022] 连接反应为：首先预变性95°C，5min;然后进行扩增循环：95°C变性30s;65°C退 火5min，共30个循环；最后95°C灭活5min。
[0023] PLP酶切反应体系：在连接后的产物管中加入0.5UExonucleaseI和0.5U ExonucleaseIII(TakaraBiotechnologyDalianChina)，以及 1yL10XExonucleaseI BufTer[500mMTris-HCl(pH8.0)，50mMMgCl2，10mMDTT]和IlyLlOXExonucleaseIII Buffer[670mMTris-HCl(pH8. 0), 67mMMgCl2,lOmMDTT]〇
[0024] 酶切反应程序为：37°C反应1个小时，然后将反应后的产物95°C灭活30min。
[0025] PLP扩增反应体系（25yL) :2. 5yLlOXTaq聚合酶Buffer[500mMKC1， Tris-HCl(pH8.3)]，1.5yLMgCl2(25mM)，2.0yLdNTP(2.5mMeach)，2.5UTaqDNA聚合 酶（TakaraBiotechnologyDalianChina),2. 5UUracil-DNAGlycosylase(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA), 1yL10XUracil-DNAGlycosylaseBuffer[200mMTris-HCl,lOmM EDTA,10mMDTT(pH8.0)](NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)，2yM引物Pl-fl9(5'-CGAGA TGTACCGCTATCGT-3'）和 2yM引物P2-r20 (5' -TCATGCTGCTAACGGTCGAG-3'）各 1yL，3yL 上述酶切产物作为扩增模板，无菌水补足到25yL。
[0026] 反应程序为：50°C激活酶活性2min，95°C变性lOmin;然后进入循环扩增：95°C热 激15s;60°C退火lmin，35个循环。
[0027] 取4yL扩增产物于2. 0 %琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果并 拍照。
[0028] Padlock探针结合Macroaary进行杂交检测，包括以下步骤：Zipcode反向互补序 列用地高辛标记后与固定在尼龙膜上的PCR扩增产物进行杂交。丁香假单胞菌黄瓜致病变 种黄瓜株系的扩增产物杂交后会显色。而非目的菌株杂交后无颜色反应。
[0029] 所述的zipcode反向互补序列为：CATCGAGTCCAACTGATCTA。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0031] (1)本发明设计了适用于丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系检测的Padlock探 针。
[0032] (2)本发明利用Padlock探针结合Macroaary技术，实现了对丁香假单胞黄瓜致病 变种黄瓜株系的检测，该探针可显著区分与丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系核苷酸序 列极相似的丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系，同时与其他类别的菌株也能显著区分， 且检测限达到了l〇〇fg/yL。检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。
[0033] (3)采用Padlock探针作为分子检测工具，有效地避免传统PCR检测方法的假阳性 现象。传统的基于PCR扩增的分子检测通常只能检测单种病原物，荧光定量PCR的出现在 一定程度上解决了这一问题，通过在反应体系中添加不同荧光染料，可以同时检测1种以 上的病原物。但是由于荧光染料的种类限制和彼此之间的干扰，采用这种方法对多种病原 物进行检测的时候效果往往不好。采用Padlock探针作为分子检测工具，结合Macroaary技 术弥补了实时荧光定量PCR检测因受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪 光源是单一光源等问题而不能同时检测非常多的病原物的不足。
【具体实施方式】
[0034] 本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或 材料，如未特别说明，均已公开。
[0035] 实施例1 :
[0036] 丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针，将丁香假单胞菌黄瓜致病 变种黄瓜株系和所有参试菌株（部分菌株表1所示）序列通过软件进行序列比对，选取核 苷酸特异部分为Padlock探针为T2端，靠近T2端的作为T1端。然后与GenBank登录的所 有细菌序列比$父以确保待检测细菌Padlock探针的特异性，最终获得探针序列如下：
[0037] TGCGTCXiCCC"WTj(X抓 CTC(iACC(iTTAGCAGCATGACCGAGATGT ACCGCTATCGTTAGATCAGTTGGACTCGATGTTGCTCGGGATCATTGAT
[0038] 双下划线：分别为T1和T2 ;下划线：通用序列P1和P2 ;粗体：用于后续杂交反应 的特异识别序列Zipcode。
[0039] 表1供试菌株及Padlock探针检测结果
[0041]
[0042] +表示阳性结果；-表示阴性结果
[0043] 实施例2 :
[0044]Padlock探针在制备丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒中的应用，应 用过程包括
[0045] (1)按照常规方式提取待测菌株的DNA
[0046] (2)PLP连接反应体系（10yL)
[0047]0? 2yLTaqDNA连接酶（40U/yL)，1yL10XTaqDNA连接酶Buffer，1yL Padlock探针（2ymol/L)，6. 8yL灭菌去离子水，1yL待测模板DNA。
[0048] 连接反应程序：首先预变性95°C，5min;然后进行扩增循环：95°C变性30s;65°C 退火5min，共30个循环；最后95°C灭活5min。
[0049] (3)PLP酶切反应
[0050]在连接后的产物管中加入 0? 5UExonucleaseI和 0? 5UExonuclease III(TakaraBiotechnologyDalianChina)，以及 1yL10XExonucleaseIBuffer[500mM Tris-HCl(pH8.0)，50mMMgCl2，10mMDTT]和lyLlOXExonucleaseIIIBuffer[670mM Tris-HCl(pH8. 0), 67mMMgCl2,lOmMDTT]
[0051] 酶切反应程序为：37°C反应1个小时，然后将反应后的产物95°C灭活30min。
[0052] (4)PLP扩增反应体系（25yL) :2.5yL lOXTaq聚合酶Buffer[500mM KC1， Tris-HCl(pH 8.3)]，1.5yL 25mM MgCl2,2.0yL dNTP(2.5mM each)，2.5U Taq DNA聚合 酶（Takara Biotechnology Dalian China),2. 5U Uracil-DNAGlycosylase(New England Biolabs, Ipswich, MA), 1y L10XUracil-DNAGlycosylase Buffer[200mM Tris-HCl, lOmM EDTA,10mM DTT (p