H8.0)] (New England Biolabs, Ipswich, MA)，2yM引物Pl-fl9(5'-CGAGA TGTACCGCTATCGT-3'）和2 y M引物P2-r20 (5 ' -TCATGCTGCTAACGGTCGAG-3'）各1 y L，3 y L上 述酶切产物作为扩增模板，无菌水补足到25 y 1。反应程序为：50°C激活酶活性2min，95°C 变性10min ;然后进入循环扩增：95°C热激15s ;60°C退火lmin，35个循环。
[0053] (5)观察实验结果：吸取3 1^扩增产物混合2 1^6\1^虹叩81^61'在2%琼脂 糖凝胶电泳上进行电泳，使用DL2000DNAMarker，利用凝胶成像系统观察分析电泳结果并 成像。能获得一条lllbp的特异性条带的即为丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系。
[0054] 实施例3 :
[0055]Padlock探针与Macroaary结合进行多重检测，包括以下步骤：
[0056] (1)探针制备取zipcode反向互补序列20yL，加入RocheDIG杂交试剂盒中的1 号4yL，充分混匀，放置于37°C温育22-24h。70°C水浴中终止反应10min，保存于-20°C冰 箱。
[0057]所述的zipcode反向互补序列为：CATCGAGTCCAACTGATCTA
[0058] (2)点样中和及紫外交联将实施例2中步骤⑵的PCR产物于沸水浴中lOmin中 后迅速放置于冰盒中，取2yL点于尼龙膜上。在干净的玻璃上放置一张比膜稍大的滤纸并 用中和液浸湿，将点样后的尼龙膜置于上面静置4min。然后放于自然空气干燥30min，置于 紫外交联仪上交联5min。将固定好的杂交膜置于10XSSC溶液中浸润平衡5min。
[0059] (3)预杂交将10ml预杂交液倒入杂交管中，按55°C杂交温度预热15min。将浸润 平衡好的尼龙膜放入预热的杂交管中，55°C预杂交lh。
[0060] (4)杂交取出杂交膜置于另一杂交管中，加入5ml含有已标记好的探针的新鲜杂 交液，55°C杂交过夜。
[0061] (5)洗膜用 100ml的洗脱液A(10mL20XSSC, 5mL5%SDS, 85mL灭菌水）于 68°C 杂交炉中洗涤30min，然后用洗脱液B(lmL20XSSC，5mL5%SDS，94mL灭菌水）于68°C杂 交炉中洗膜两次每次15min。然后用WashingBuffer(50mL马来酸加入150yL吐温20)于 室温下轻摇洗脱5min。
[0062] (6)显色将尼龙膜转置于 1XBlockingBufferr(2mL1 %blocking solution, 18mL马来酸）静置 30min，接着放于Antibodysolution(3yL anti-DIG-AP-conjugate, 2mL1%blockingsolution, 18mL马来酸）中静置 30min， WashingBuffer轻摇洗脱 2 次每次 15min，在 20mLDetectionbuffer中平衡 5min，最后 置于 10ml现配的Colorsubstrate(20mLDetectionbuffer, 400yL四挫硝基蓝stock solution)中避光显色l-7h。尼龙膜出现明显清晰的条带后，用灭菌水浸泡5min停止反应， 观察拍照。
[0063]目的菌株（丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系）杂交后会显色。而非目的菌株 杂交后无颜色反应。
[0064] 实施例4 :
[0065]Padlock探针的特异性检测：
[0066] 利用实施例2所述的方法，对包括表1中的菌株及其他菌株DNA进行Padlock探 针检测。
[0067] 结果显示：
[0068] 所有的丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系反应结果均为阳性，都能得到一条 lllbp的特异性条带。而其余参试菌株（包括所有丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系） 及空白对照均无扩增产物产生。说明此探针对丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系具有极 好的特异性。
[0069] 同样的，利用实施例3所述方法，将扩增后的产物取2ul点在尼龙膜上进行斑点杂 交技术，目的菌株杂交后显色，并且结果与PLP凝胶电泳实验结果相一致。而非目的菌株杂 交后无颜色反应。结果表明此方法能够将丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系与非丁香假 单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系完全区分开。
[0070] 实施例5 :
[0071]Padlock探针的的灵敏度检测
[0072] 将DNA浓度为lng/yL的目的菌株DNA按10倍梯度稀释，依次为lng/yL，100pg/ yL，10pg/yL，lpg/yL，100fg/yL，10fg/yL，lfg/yL共七个梯度。连接体系中加入 100fg目的DNA基因组，都能扩增出lllbp的目的片段。所以黄瓜株系探针的检测灵敏度为 100fg/yL。Padlock探针结合Macroaary杂交检测革E标基因组DNA的灵敏度也为lOOfg/y L〇
[0073] 实施例6 :
[0074] 人工模拟带菌种子的检测
[0075] 利用实施例3的方法，Padlock探针结合Macroarray技术进行了病原菌的高通量 检测，步骤包括
[0076] 1)取约200颗健康的黄瓜种子浸泡于0D为1的丁香假单胞菌黄瓜治病变种黄瓜 株系菌悬液中4h，然后将带菌种子自然风干。
[0077] 2)将风干后的带菌种子和健康种子按照100/1000、50/1000、10/1000、1/1000和 0/1000混合。浸泡于50ml无菌水中，震荡4h后，取浸提液提取DNA作为模板进行实验。
[0078] 3)利用实施例3的方法进行检测，结果显示，能将1粒带菌种子从1000粒健康的 种子检测出来，模拟种子带菌检测率达到0. 1% (1/1000)。
[0079] 实施例7:
[0080] 市售黄瓜种子检测
[0081] 从市售的黄瓜种子中检测丁香假单胞黄瓜致病变种甜黄瓜株系
[0082] 用上述的丁香假单胞黄瓜致病变种黄瓜株系的Padlock探针及检测方法检测市 售的黄瓜种子，包括：
[0083] (1)运用探针对39份不同来源的市售黄瓜种子进行检测，每份种子取50g，分别将 待测种子加l〇〇mL无菌水浸泡4h，取浸泡液10000r/min离心10min，弃上清，重复2次，加 入5mL无菌水悬浮沉淀并提取DNA作为模板进行市售黄瓜种子检测，并设置阴性对照和阳 性对照。
[0084] (2)参照实施例3所述方法利用Padlock探针结合Macroaary技术检测样品。
[0085] 结果表明从市售的39份黄瓜种子中未检测到种子带菌。
[0086] 人工接种实验及市售黄瓜种子检测实验表明该检测体系可成为黄瓜种子带菌检 测的有效手段。
【主权项】
1. 丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I 所示。2. 权利要求1所述的探针在制备丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系检测试剂盒中 的应用。3. 权利要求1所述的探针与Macroaary结合在制备丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株 系高通量检测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明提供了丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系Padlock探针及应用，申请人通过将丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系与其他细菌的序列用软件进行序列比对，选取核苷酸特异部分为Padlock探针为T2端，靠近T2端的作为T1端，设计了一条特异性极好的Padlock探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。该探针可显著区分与丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系核苷酸序列极相似的丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系，同时与其他类别的菌株也能显著区分，且检测限达到了100fg/μL。检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。可广泛适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104962659
【申请号】CN201510466278
【发明人】徐瑞, 朱校奇, 彭福元, 胡白石, 黄亮, 黄艳宁, 田艳丽, 彭斯文, 谢进, 范海珊
【申请人】湖南省农业生物资源利用研究所
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月31日