一种铅-IgE螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种铅-I班馨合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] I班主要由粘膜相关淋己样组织产生，其中大部分是由胃肠淋己样组织所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。哺乳期产妇腺组织含有大量I班产生细胞， 该些细胞主要来自胃肠。在人类，还有少量的I班来自骨髓。人出生后4~6月开始合成 I班，4~12岁血清中含量达成人水平，血清型I班总Ig的10%左右，半衰期约5~6天。 I班有I班1和I班2两个亚类。I班1主要存在于血清中，约占血清中I班的85%，a1链分 子量为56kD;1班2主要存在于外分泌液中，少部分W血清型I班存在，约占血清中I班的 15%，a2链缺乏较链区，分子量为52kD。血清中的I班除单体形式外还有由J链共价相连 的二聚体或=聚体等形式。分泌型I班是由J连接的双体和分泌成分所组成，主要存在于 初乳、唾液、泪液、胃肠液、支气管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型I班通过与相应的病原微生物（如脊髓灰质炎病毒）结合，阻抑其吸附到易感细胞上，分 泌型I班还可中和毒素如霍乱弧菌毒素和大肠杆毒素等。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染 可能与I班合成不足有关。慢性支气管炎发作与分泌型I班的减少也有一定关系。产妇可 通过初乳将分泌型I班传递给婴儿，该也是一种重要的自然被动免疫。嗜酸性粒细胞、中性 粒细胞和巨瞻细胞表达化aR，血清型单体I班可介导调理吞瞻和ADCC作用。此外，分泌 型I班具有免疫排除功能，即分泌型I班结合饮食中大量的可溶性抗原W及肠道正常菌群 或病原微生物所释放的热原物质，防止它们进入血液。
[0003] 众所周知，铅（Pbckel，Pb)与人体的健康息息相关，首先其是人体维持健康所必 需的微量元素，其存在于多种氨化酶中，催化氨的氧化还原反应，参与多种酶蛋白的合成和 细胞激素及色素的代谢，具有促进铁的吸收和红细胞的增长、激活酶形成辅酶、增强膜岛 素、降血糖、保护屯、血管等作用，因此如果人体缺乏铅，会导致疾病的发生。但是，事实在生 活中，由于环境污染，人体内很少缺乏铅，相反铅的含量常常过量，常常导致疾病的发生，甚 至危及生命。
[0004] 铅在体内的含量超过一定水平就会对健康引起难W恢复的损害，它可W铅烟，铅 尘和各种氧化物形式被人体经呼吸道和消化道摄入体内，通过与巧离子的竞争作用，氧化 损伤，细胞调亡等机制，引起W神经、消化、造血系统障碍为主的全身性、渐进性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害还可能遗传到下一代。贫血是铅中毒的早期症状之一，铅可抑制血 红素合成过程中许多酶的活性。铅中毒可致血管疫李、腹绞痛、视网膜小动脉疫李和高血 压，时常导致细小动脉硬化。铅的肾损害常表现为间质性肾炎或萎缩性肾炎等病变，肾小管 重吸收功能下降是早期的症状。铅接触还可能影响生殖功能，接触铅的女性发生不孕症、流 产及死胎的机率增多，并可通过胎盘转移到胎儿身上。经口铅中毒者肝脏为主要受损器官 之一，可引起肝肿大呈现黄痘，甚至肝硬变或肝坏死，肝损害可能是肝内小动脉疫李引起 局部缺血所致。铅引起化咐代谢障碍、抑制含琉基酶，干扰植物神经。
[000引铅与多种蛋白质之间关系密化可W与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铅毒性研究的深入，人们逐渐认识到铅与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铅的毒性机理的关键所在，因此，对铅和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铅与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铅之 间的关系还不清楚，因而加强对于铅与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0006] 针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-I班馨合物及其制备方 法，并建立铅-I班馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铅-I班馨合物在评价一个 地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-I班馨合物可W间接反映 该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区铅污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种铅-I班馨合物，铅离子与 I班通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的铅-I班馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0009] A)铅与I班的馨合反应：在提纯源于人体的I班或按照生物学方法重组的I班中 加入铅离子进行馨合反应，得到反应溶液；
[0010] B)纯化铅-I班馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 I班W及多余的铅离子，即得铅-I班馨合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下；
[0012] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铅-I班馨合物 复溶；
[001引似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与I班特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] 做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，I班与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0016] (5)收集；收集洗脱液I;
[0017] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0021] (10)收集；收集洗脱液II;
[002引 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铅-I班馨合物。
[0023] 其中，上述铅-I班馨合物的制备方法，还包括步骤C);对铅-I班馨合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下：
[0025] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[002引 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的铅-I班馨合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测；在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铅W及检测铅的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的铅-I班馨合物在制备检测人体内铅-I班馨合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的铅-I班馨合物作为标准品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获I班的物质或捕获铅的物 质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测铅-I班馨合物的方法，W已知含量的上述的铅-I班 馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铅-I班馨合物与酶联免疫结 合法、提纯铅-I班馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-I班馨合物与电感禪合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的铅-I班馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成铅-I班馨合物；
[00巧]2.本发明首次提出铅-I班馨合物可用于制备检测血样中铅-I班馨合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了铅-I班馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测铅-I班馨合 物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-I班馨合物 可W间接反映该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区铅污染程度。本发明 建立的铅-I班馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 局。
【附图说明】
[0037]图1为本发明所述的铅-I班馨合物的非变性电泳条带图；
[003引图2为本发明所述的铅-I班馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分析图。
【具体实施方式】
[0039] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0040] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0041] 磯酸盐溶液为0. 05-0.Imol/L化2册〇4溶液或0. 5-lmol/L化2册〇4溶液；
[0042] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0044] 捕获I班的物质购买自艾美捷科技有限公司的型号为Abeam油171396的兔 Anti-I班抗体；其中，本发明所述与I班特异性结合的物质、抗I班抗体、抗I班抗体均为 捕获I班的物质；
[0045] 捕获铅的物质为己傲得生物科技有限公司生产的型号为AP7019的抗铅抗体；其 中，本发明所述与铅特异性结合的物质、化抗、抗化抗体、抗铅抗体均为捕获铅的物质；
[0046] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0047] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0048] 洗漆液为含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2册〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C