溶液，调抑7.2-7.6,分装于试管中，高度为试 管的 1/3-1/4,12TC灭菌 20min;
[0052] ②待培养基冷却后，取10yL供试菌株新鲜种子液接种于膜蛋白腺液体培养基； [005引⑨28°C培养，分别于2d、4d后观察结果；
[0054] ④每次观察时，沿管壁慢慢加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面出现 红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可在培养液中加入己離约山以充分震荡，静置片刻，待 己離浮至液面后再加嘲噪试剂，在己離和试剂液层界面出现红色，即为阳性反应。
[00巧]结果均无红色产生，结果如表1所示，故分析生防菌在嘲噪为生理生化指标情况 下为阴性。
[0056] 表1嘲噪试验结果
[0057]
[005引注；"+ "为阳性，"-"为阴性。
[0059] (2)巧樣酸盐生长试验
[0060] ①培养基配制：分别取化C1 1.Og，M拆〇4 ? 7&0 0. 2g，畑4畔〇4〇. 5g，巧樣酸钢 2.Og，琼脂18.Og，0. 04%酪红水溶液10血；蒸馈水补充至1000. 0血，调抑为7. 0,然后加 入指示剂，分装试管；
[0061] ②12TC灭菌20min，摆斜面；
[0062] ⑨挑取新鲜培养的供试菌株单菌落在斜面上划线接种，28°C培养3-7d;
[0063] ④观察实验结果；培养基变藍色或桃红色为阳性，否则为阴性。
[0064] 除接生防菌Kgl不变色W外，接其他生防菌均变为桃红色，其余生防菌株为阳性 如表2所示；
[0065] 表2巧樣酸盐生长试验结果
[0066]
[0067] 注；"+ "为阳性，"-"为阴性。
[006引 （3)最适碳源利用测定
[0069] ①选取可溶性淀粉、脱氨酸、抗坏血酸、脯氨酸、精氨酸、麦芽糖、酪氨酸、甘露醇、 葡萄糖、山梨醇、甘氨酸、鼠李糖、果糖、草酸、苏氨酸、半乳糖、等碳源利用测定；
[0070] ②基本培养基；（NH4)2S042.Og，Na&PO* ? &0 0. 5g，K2HPO4O. 5g，M拆〇47&0 0. 2g， CaCl2? 2&0 0.Ig，蒸馈水补充至1000.OmL，pH6. 5,分装于试管中（每支试管4mL)，121°C 灭菌20min;
[0071] ⑨将所得碳源配制成5%的水溶液，灭菌后加入试管中，使其终浓度为1% ;
[0072] ④取供试菌株种子液10UL分别加到不同碳源中，并设置空白对照，然后在28°C， 200;r/min条件下，摇培40h;
[0073] ⑥若出现明显浑浊，说明该碳源可W被利用；若无，则需从中取出lOuL，转接到 相应的新的碳源试管中，同样条件下，连续培养3次；如果仍无浑浊，则证明此碳源不适合 被供试菌株利用。
[0074] 实验结果如下；
[0075] 可利用碳源有；山梨醇、鼠李糖、微C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、脱 氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖；
[0076] 不可利用碳源有；精氨酸、草酸、甘氨酸。
[0077] (4)最适生长温度的测定
[0078] ①LB培养基配置；膜蛋白腺10.Og，酵母提取物5.Og，氯化钢5.Og，蒸馈水补充至 1000. 0血，分装于试管，121°C灭菌20min后冷却；
[0079]②将菌株分别接入试管中，分别置于4°C、20 °C、30 °C、40°C、50 °C、60 °C、70°C、 80°C、90°C、99°C摄氏度下培养10min(40°C温度培养12h);
[0080] ⑨划线培养；分别将上述不同温度下的菌株进行划线，37°C培养24小时，分别观 察其生长情况。
[0081] 对生防菌的生长温度进行测定，结果如下：
[0082]表3最适生长温度的测定结果
[0083]
[0084] 注；" + "为能生长，为不能生长。
[0085] (6)括抗菌耐盐性测定
[0086] 培养2化后，取出观察各试管中菌株的生长状况，结果如下：
[0087] 表4生防菌耐盐性测定结果
[0088]
[0089] 注；" + "为菌株生长，为不生长。
[0090] 由表3-2可W看出，除菌株Kgl只能在盐浓度为0-7 %时生长，其余4种括抗菌在 盐浓度为0-10%均能生长，且在盐浓度为0的环境中生长状况最佳，在实验范围内，随盐浓 度的增加其生长趋势逐渐减弱，直至盐浓度为12%及W后，生防菌不再生长。
[0091] (7)接触酶试验
[0092] ①用液体培养基摇培菌株16h;
[0093] ②接种环薩取培养16h的新鲜菌液，涂在在已滴有3%过氧化氨水溶液的玻片上；
[0094] ⑨观察结果；有气泡产生为阳性，无气泡为阴性。
[0095] 结果发现Kg2A新鲜菌液涂在在已滴有3%过氧化氨水溶液的玻片上时，均有气泡 产生；显示接触酶实验结果为阳性。
[0096] 表5接触酶试验结果
[0097]
[009引注；"+ "为阳性，"-"为阴性 [009引 做氧化酶试验
[0100] ①用液体LB培养基摇培菌株16h;
[0101] ②在干净培养皿里放一张滤纸，滴加1%二甲基对苯撑二胺盐酸盐水溶液，仅使滤 纸湿润即可，不可过湿；
[0102] ⑨用接种环取培养16h的新鲜菌液，涂抹在湿润的滤纸上；
[0103] ④观察结果；在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，10-60S现红色者为延迟反应， 60sW上现红色者不计，按阴性处理。
[0104] 结果显示：在涂抹菌苔后的60S内均未产生颜色的变化；全部显示阴性。
[0105] 表6氧化酶试验结果
[0106]
[0107] 注；" + "为阳性，为阴性
[0108] (9)对抗生素的敏感性研究
[0109] 用滤纸片法测定菌株Kg2A对不用抗生素的敏感性，用打孔器制备直径7毫米的滤 纸片，高温灭菌。在溶化后冷却至50摄氏度~55摄氏度的LB固体培养基中加入1毫升 供试菌株种子液，摇匀后倒平板，将灭菌后的滤纸片置于平板中，然后在滤纸上添加抗生素 溶液，添加量相当于氨节青霉素Amp50微克每毫升、卡那霉素Kana50微克每毫升、氯霉素 化1 50微克每毫升、链霉素Str50微克每毫升、四环素Tet50微克每毫升、红霉素化y50 微克每毫升、利福平化f50微克每毫升、头抱霉素Cef50微克每毫升。放置于28摄氏度 恒温培养箱内培养，分别于24小时、48小时观察结果。结果如下：
[0110] 表7抗生素抗性实验结果
[0111]
[011引注；" + "为出现抑菌圈，"-"为不出现抑菌圈。
[011引实施例3
[0114] 生防园Kg2A对病原园的抑园试验
[0115] 在事先备好的PDA平板中央，接种直径为6mm的供试病原菌菌块，同时在距PDA平 板中屯、25mm的对称两点处接种待测细菌，每株菌重复3次，28°C恒温倒置培养，6d后观察抑 菌状况。
[0116]
[0117] 实施例4
[0118] 形态对時试验
[0119] 培养基：膜蛋白腺10.Og，酵母提取物5.Og，氯化钢5.Og，琼脂粉20g，蒸馈水补充 至 1000. 0血，121°C灭菌 20min。
[0120] 通过对生防菌Kg2A进行对時培养试验，结果显示Kg2A的第1-10代稳定括抗镶抱 炭痘菌和胶抱炭痘菌。
[0121] W上所披露的仅为本发明的较佳实施例，不能W此来限定本发明的权利范围，因 此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
【主权项】
1. 一株生防菌Kg2A，该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，保藏 号为：CGMCC No. 10918。2. -种权利要求1所述生防菌的培养基，其特征在于，所述培养基为LB培养基或者 YEP培养基。3. 权利要求1所述的生防菌Kg2A在防治植物真菌病害中的用途。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述植物真菌病害由镰刀菌、镰孢炭疽菌和 /或胶孢炭疽菌引起。5. -种生物防治制剂，含有权利要求1所述的菌株或其发酵液。6. 权利要求5所述的生物防治制剂在防治植物真菌病害中的用途。7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物真菌病害由镰刀菌、镰孢炭疽菌和 /或胶孢炭疽菌引起。8. -种植物真菌病害的生物防治方法，其特征在于，向具有真菌病害的植物施用权利 要求1的菌株或权利要求5的生物防治制剂。
【专利摘要】本发明属于微生物农药领域，具体涉及一株生防菌Kg2A及其在防治胡椒枯萎病和炭疽病的应用。该生防菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Kg2A，保藏编号为CGMCC No.10918。本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和生理生化特性、培养方法，并验证了其具有抑制胡椒枯萎病病原菌镰刀菌和炭疽病原炭疽菌的活性。CGMCC No.1091820150626
【IPC分类】A01N63/00, C12N1/20, C12R1/07, A01P3/00
【公开号】CN104988096
【申请号】CN201510430348
【发明人】郑肖兰, 李锐, 吴伟怀, 习金根, 贺春萍, 易克贤, 梁艳琼, 郑金龙, 秦周
【申请人】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月21日