一株高效抑制镰刀菌和炭疽菌的生防菌Kg2A及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药领域，具体设及一株解淀粉芽抱杆菌Kg2A及其在防治胡 椒枯萎病和炭痘病的应用。
【背景技术】
[0002] 胡椒是我国主要热带农产品，是海南广大农民创收的重要农作物，也是海南省经 济发展的一大支柱，它在国民经济的发展过程中有着愈来愈重要的作用。该是因为，一方 面，它的种子含有挥发油、胡椒碱、粗脂肪、粗蛋白等，是人们喜爱的调味品；另一方面，医学 上胡椒可作为健胃剂、调热剂、利尿剂及支气管粘膜刺激剂，有散寒、健胃、温中之功效，可 治疗消化不良、积食不消、胃寒疼痛、屯、腹冷痛、寒湿反胃、大肠寒滑、虚胀冷积、支气管炎、 冷频、梅毒、感冒、风湿骨痛和肺塞咳嗽疲多等多种疾病；此外，胡椒产业已成为海南岛农业 经济发展的重要支柱和农民脱贫致富的主要经济来源。另一方面，在生产上，胡椒是一种 重要的热带香辛植物，原产于印度西高止山脉的热带雨林中，目前我国海南、广东、广西、云 南、福建等省（区）均有种植。海南岛作为我国主要胡椒生产区W及胡椒育种重点区域，植 椒面积约占中国植椒总面积的90%W上，适宜种植胡椒的地域是有限的，海南省种植胡椒 的气候和立地条件得天独厚，胡椒产品的质地较越南等周边传统生产国家好。然而，海南胡 椒一般每亩每年可产干胡椒200 - 300市斤，管理良好的胡椒园每亩年产500 - 600市斤， 小面积高产的亩产一年可达1200市斤，总体来说单位面积平均产量不高，究其原因恐怕是 多方面的，但是有一点不可否认的是由胡椒病害所带来的严重影响。长期W来，海南岛胡椒 品种单一化，W及长期连作均有利于各种病原菌的反复侵染，特别是胡椒癌病等±传病害 的发生给胡椒生产带来严重的危害。
[0003] 生防细菌在植物病害的防治中占有十分重要的地位，其主要优势有；（1)生防细 菌复杂多样的生防机制使病原菌不易产生抗药性。生防细菌的抑菌机理有多种，并且通常 是两种W上的抑菌机制协同作用起到防治病害的效果。在植物病害防治实践中，普遍采用 的方法是同时使用活菌体和其括抗性代谢产物，该有利于各种抑菌机制互促互补，从而使 生防细菌的生防潜力得到最大限度的发挥。此外，细菌产生的抑菌活性物质（如细菌素） 能同时影响敏感菌的多种代谢途径，如此W来，因病原菌发生突变而对细菌素产生抗性的 可能性就不像抗生素那样容易。（2)生防细菌的活体应用使得其防效较之其它微生物更为 持久是因为生防细菌大多由农田生态系统中分离出来，一般情况下具有与病原菌相同或相 近的生态适应及对寄主植物的亲和性，定殖相对容易，再加上其繁殖迅速，使应用细菌活体 防治病害成为可能。而用于生防的其他微生物类群，多数是利用它们的代谢产物防治病害。 相比之下，生防细菌定殖后能大量繁殖并建立产生抑菌物质的"活工厂"防效会更持久。（3) 代谢旺盛、产生括抗物质周期短，与生防真菌或放线菌相比生防细菌繁殖速度快得惊人，在 适宜的条件下，几十分钟就分裂繁殖一次，一天W后便产生数千万个后代。液体培养条件 下，44小时即可达产括抗物质的高峰期。该有利于节约时间，缩短生产周期，降低生产成本。
[4] 有利于维持有益微生物的生态平衡，由于生防细菌所产生的抑菌物质通常直接针对相 应的病原菌起作用，特异性强，故此不会对农业生态系统其它有益微生物产生不利影响，有 助于维持有益微生物的生态平衡。
[0004] 从胡椒上分离筛选获得对胡椒病害枯萎病和炭痘病具有括抗作用的生防菌株，对 胡椒病害的防治具有重要的意义，但目前相关技术仍然很薄弱，至今有效防治胡椒病害的 括抗细菌未见正式报道，也没有防治胡椒病害的生物农药的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的针对现有技术的空白提供一株生防菌Kg2A及其在防治胡椒枯萎中 的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予W实现。
[0007]本发明采用的细菌是解淀粉芽抱杆菌炬acillus amyloliquefaciens)，保藏号为 CGMCC.No.10918。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0008] 本发明的生产菌株Kg2A分离自海南省大坡镇的胡椒叶片，经菌落和形态的显微 观察、染色反应、常规生理生化特性试验W及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为解淀粉芽抱 杆菌炬acillus amyloliquefaciens)的一个新菌株，具有W下特征；（1)菌株呈直杆状，常 W成对或链状排列，具圆端或方端；芽抱楠圆、卵圆、柱状、圆形，无英膜；革兰氏染色阳性； (2)通过嘲噪实验、接触酶实验、氧化酶、巧樣酸盐生长实验等生理生化指标，并结合《伯杰 细菌鉴定手册》，鉴定结果Kg2A属于枯草芽抱杆菌属，结果与分子鉴定一致。
[0009] 生防菌Kg2A的基本培养基为LB培养基或YEP培养基。
[0010] 生防菌Kg2A的可利用碳源有；山梨醇、鼠李糖、维生素C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、 甘露醇、麦芽糖、脱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。
[0011] 生防菌Kg2A对环境的适应能力比较强，可W在4°c-90°c的温度范围内生长，在盐 浓度为0-10%均能生长。
[0012] 本发明还研究了生防菌Kg2A对不同抗生素的敏感性，为化学防治打下基础。
[0013] 本发明的菌株Kg2A对镶刀菌、镶抱炭痘菌和胶抱炭痘菌具有抑制作用。
[0014] 本发明的菌株Kg2A或其发酵液可W作为生物防治制剂使用，用于防治植物真菌 病害。
[0015] 本发明还提供一种解淀粉芽抱杆菌炬acillus amyloliquefaciens) Kg2A的应用， 该菌株可W用于防治橡胶树炭痘病、甘庶赤腐病和胡椒枯萎病。
[0016] 本发明还提供一种植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用菌 株Kg2A或其发酵液，也可化施用含有上述菌株或其发酵液的生物防治制剂，也可W与其他 生物防治制剂联合施用。
[0017] 本发明的菌株Kg2A具有广谱抗菌性，培养简单，适应性强，抗菌能力稳定，可W广 泛应用于多种植物真菌病害的防治。
【附图说明】
[001引 图1为Kg2A和其他生防菌的16SrDNAPCR产物电泳图，泳道M为DNAmarker, 1 为Kgl，2 为Kg2, 3 为Kg2A，4 为Kg4。
[0019]图2为生防菌Kg2A的革兰氏染色结果。
[0020] 图3为生防菌Kg2A对镶抱炭痘菌的括抗效果图。
[0021] 图4为生防菌Kg2A对胶抱炭痘菌的括抗效果图。
[0022] 图5Kg2A对胶抱炭痘菌的括抗效果图。
[002引图6Kg2A对镶刀菌的括抗效果图。
【具体实施方式】[0024] 实施例1
[00巧]菌株Kg2A的分离培养和筛选纯化 [002引 1.采样
[0027] 样品为海南省大坡镇的胡椒叶片，将采集好的叶片放入塑料袋中并记录。
[002引1. 2材料表面消毒与括抗细菌分离
[0029] 1. 2. 1清水冲洗与剪取病叶
[0030] 用清水洗去叶片上的灰尘砂碱，惊干。用剪刀在病健交界处剪取大小为5X5mm的 小叶片备用。
[0031] 1.2. 2样品消毒
[0032] 将剪取的小病叶放入烧杯，用升隶浸泡30秒，在浸泡的过程中应注意不断轻轻揽 动小病叶，然后用无菌水冲洗S次，惊干，备用。
[0033] 1. 2. 3细菌分离培养
[0034] 用灭过菌的綴子将剪取的小叶片贴放到PDA固体培养基上，每皿均匀摆放4块，再 将培养皿用保鲜膜密封。倒置放入恒温培养箱中，28°C培养。每隔1化进行观察4她后将 长出的菌体转接至相同的培养基上，28°C培养4她后进行纯化；同时，将纯化后所得的细菌 采用梯度稀释涂布LB平板培养基中，28°C培养4她后挑取单菌落接至相应培养基斜面上。
[0035] 1. 3括抗细菌的筛选
[0036] 1.3. 1细菌的纯化
[0037] 将放置于8~10°C培养箱中的斜面试管取出，在无菌操作台中，将液体LB培养基 分装到锥形瓶中，然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中，封口。28°C摇床上震荡培养约 12小时，取出。然后用移液器吸取200yL于LB固体培养基上，涂抹椿涂抹均匀，于28°C培 养箱培养。然后再通过无限稀释法处理获得单一菌株。
[00測实施例2
[00測 菌株Kg2A的鉴定
[0040] 1、微生物学特性；
[0041] 对在37°C培养箱中划线培育的生防菌株进行形态特征观察，发现生防菌株Kg2A 呈直杆状，较少成链，具圆端或方端；芽抱楠圆、卵圆、柱状、圆形，无英膜，为芽抱杆菌属。经 革兰氏染色后菌体均呈现出藍紫色，为革兰氏阳性菌。
[0042] 2、分子生物学鉴定：
[004引 （l)DNA提取；采用本领域通用的试剂盒进行基因组DNA的提取；
[0044] (2)PCR反应；细菌通用引物8F和1492R，由英潍捷基（上海）贸易公司合成，结构 如下；8F5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0045] 1492R5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，
[0046] 生防菌株Kg2A的16SrDNA基因扩增结果如图1所示，扩增条带长度约1500bp，与 预期大小一致；
[0047] (3)将PCR鉴定正确的重组菌送英潍捷基（上海）贸易公司基因测序。
[0048] 通过在NCBI网上进行比对分析，结果显示与枯草芽抱杆菌属的同源性为99%，因 此推断Kg2A菌株属于枯草芽抱杆菌属。
[0049] 3、生防菌的生理生化鉴定
[0050] (1)嘲噪试验
[0051] ①培养基配制：取1%膜蛋白腺水