一种苏云金芽孢杆菌、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病虫害的生物防治技术领域，具体设及一种苏云金芽抱杆菌，同 时还设及一种苏云金芽抱杆菌的制备方法及应用。
【背景技术】
[000引棉铃虫化elicoverpaarmigera)属鱗翅目夜蛾科昆虫的一种，是棉花蕾铃期的一 大害虫，广泛分布在中国及世界各地，寄主植物有20多科200余种。棉铃虫是棉花蕾铃期 重要钻蛙性害虫，主要蛙食蕾、花、铃，也取食嫩叶。该虫是中国棉区蕾铃期害虫的优势种， 近年为害十分猎嫩。
[0003] 棉铃虫成虫白天隐藏在叶背等处，黄昏开始活动，取食花蜜，有趋光性，卵散产于 棉株上部。幼虫5~6龄。初龄幼虫取食嫩叶，其后为害蕾、花、铃，多从基部蛙入蕾、铃，在 内取食，并能转移为害。受害幼蕾巷叶张开、脱落，被蛙青铃易受污染而腐烂。老熟幼虫吐 丝下垂，多数入±作±室化蛹，W蛹越冬。棉铃虫天敌很多，已知有赤眼蜂、姬蜂、寄蛹等寄 生性天敌和草龄、黄蜂、猎睹等捕食性天敌，及一些细菌、真菌、病毒等可对棉铃虫的卵和幼 虫起到抑制作用。
[0004] 苏云金芽抱杆菌炬acillusthuringiensis，简称Bt)于1901年首次发现于日本 (LamPH,BoonCS,YngNY,etal.Aedesalbopictuscontrolwithsprayapplication ofBacillusthuringiensisisraelensis,strainAM65-52[J].SoutheastAsianJ TropMedPublicHealth, 2010, 41 (5): 1071-1081)，是一种广泛分布于自然界的革兰氏 阳性菌（GobattoV,GianiSG,CamassolaM,etal.Bacillusthuringiensisisolates entomopathogenicforCulexquinquefasciatus(Diptera:Culicidae)andAnticarsia gemmatalis(Lepidoptera:Noctuidae)[J].E5razJBiol, 2010, 70 (4): 1039-1046);因其 能够产生对多种昆虫具有很强毒性作用的杀虫晶体蛋白，并对人畜无害、对环境无污染 (LopesJ,Arantes0M,CenciMA,etal.EvaluationofanewformulationofBacillus thuringiensisisraelensis[J].化azJBiol, 2010, 70 (4): 1109-1113)，而成为全球应用 最成功的生物杀虫剂之一。
【发明内容】
[00化]本发明的目的是提供一种可防治植物棉铃虫虫害的苏云金芽抱杆菌。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种苏云金芽抱杆菌的制备方法。
[0007] 本发明的第=个目的是提供一种苏云金芽抱杆菌在防治植物棉铃虫虫害方面的 应用。
[000引为了实现W上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 一种苏云金芽抱杆菌，该菌株为苏云金芽抱杆菌炬acillusthuringiensis) ML53,于2014年9月24日保藏在中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO;M2014446。
[0010] 一种上述的苏云金芽抱杆菌的制备方法，包括下列步骤：
[0011] 1)对采集自大田的死亡棉铃虫进行分离，得到苏云金芽抱杆菌菌株；
[001引 。^初解棉铃虫和二龄幼虫为试虫，进行生物活性测试，通过比较初解棉铃虫 死亡率和W二龄幼虫为试虫时棉铃虫的化蛹率、羽化率，筛选得到所述的苏云金芽抱杆菌 ML53。
[0013] 步骤1)中，从死亡棉铃虫中分离苏云金芽抱杆菌菌株的方法包括：
[0014] a.采集大田中死亡的棉铃虫，在己醇溶液中浸泡，然后用氯化隶溶液消毒，再用无 菌水冲洗后，于灭菌的研鉢中研磨，加入无菌水得研磨液原液；
[0015] b.取步骤a所得研磨液原液的稀释液，涂布于NA培养基平板上，在30°C下培养， 挑取似化菌落涂片，用石炭酸复红染色镜检，将检出的化菌株划线培养、分离纯化，备用。
[0016] 所述似化菌落的特征为菌落乳白色，不透明，表面粗趟，边缘不整齐。
[0017] 步骤a中，所述己醇溶液中己醇的体积分数为75% ;所述氯化隶溶液中氯化隶的 质量分数为1%。
[001引步骤a中，在己醇溶液中浸泡时间为30s;用氯化隶溶液消毒时间为3min。
[0019] 步骤a中，制备研磨液原液时，加入无菌水的量为：每1头棉铃虫加入2~3ml无 菌水。
[0020] 步骤b中，所述研磨液原液的稀释液的稀释倍数为10~100。
[0021] 步骤b中，所述NA培养基的配方为：牛肉浸膏5g，蛋白腺lOg，氯化钢5g，琼脂18g， 加蒸馈水至1000ml。
[002引步骤。中，所述生物活性测试的方法包括：
[0023] i)将步骤1)所得苏云金芽抱杆菌菌株活化培养，离屯、后用灭菌水悬浮得悬浮液；
[0024] ii)将步骤i)所得悬浮液与饲喂棉铃虫的人工饲料混合均匀，得混合饲料；
[002引iU)将初解棉铃虫接于步骤U)所得混合饲料上，饲养化后，统计死、活虫数量， 计算死亡率：
[0026] 死亡率（％ )=死亡虫数/供试虫数X 100;
[0027] 将二龄幼虫接于步骤ii)所得混合饲料上，饲养至羽化，统计化蛹数和羽化数，计 算化蛹率和羽化率；
[00測化蛹率（％ )=化蛹虫数/供试虫数X100 ;
[0029] 羽化率（％ )=羽化虫数/化蛹虫数X 100。
[0030] 步骤i)中，所述活化培养采用NB培养基，配方为：牛肉浸膏5g，蛋白腺lOg，氯化 钢5g，加蒸馈水至1000ml。
[0031] 步骤U中，所述悬浮液中菌株的浓度为300yg/ml。
[0032] 步骤ii)中，所述人工饲料的配方为；每500ml人工饲料含有琼脂8g、麦款70g、干 酵母lOg、玉米油3ml、山梨酸Ig、抗坏血酸1. 5g。所述麦款为无菌麦款。
[0033] 人工饲料的制备方法为；将琼脂加水煮沸使琼脂融化，在温度低于90°C后依次加 入无菌麦款、干酵母、玉米油、山梨醇、抗坏血酸，揽拌均匀，定容即得。
[0034] 步骤ii)中，悬浮液与人工饲料的体积比为1:25。
[00巧]一种上述的苏云金芽抱杆菌在防治植物棉铃虫虫害方面的应用。
[0036] 本发明的苏云金芽抱杆菌，是从大田中死亡的棉铃虫分离筛选出的对棉铃虫具有 防治效果的一株细菌菌株ML53,该菌株对初解棉铃虫幼虫具有很高的杀虫活性，并能有效 阻止棉铃虫幼虫化蛹及羽化，使幼虫发育历期延长，发育缓慢，不能生长为成虫，从而对防 治植物棉铃虫虫害具有显著的效果。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[003引【具体实施方式】中，细菌平板培养用NA培养基，配方为：牛肉浸膏5g，蛋白腺lOg，氯 化钢5g，琼脂18g，加蒸馈水至1000ml;液体培养用NB培养基，配方为：牛肉浸膏5g，蛋白腺 lOg，氯化钢5g，加蒸馈水至1000ml。
[0039] 实施例1
[0040] 本实施例的苏云金芽抱杆菌的制备方法，包括下列步骤：
[0041] 1)菌株分离；对采集自大田的死亡棉铃虫进行分离，得到苏云金芽抱杆菌菌株， 具体为：
[0042] a.采集大田中死亡的棉铃虫2头，在体积分数为75%的己醇溶液中浸泡30s，然后 用质量分