一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物与生物技术领域，具体设及一株从市售黑胡椒表面筛选出的具 有高真菌抑制活性的解淀粉芽抱杆菌及其在黑胡椒储藏中的应用。
【背景技术】
[0002] 丝状真菌和酵母是导致发酵乳制品、谷类食品、果蔬W及粮食等食品发生腐败的 普通微生物类群。据估计，全球5%~10%的食品损失是由真菌引起的。在西欧，每年由 霉菌引起的面包腐败导致的经济损失高达20亿英镑。据报道青霉和曲霉是引起食品腐败 的主要真菌微生物。我国是一个农业大国，由于农作物病虫害发生普遍和危害严重，每年 因病虫害造成的粮食损失1，000万吨W上，其中80%W上的农作物病害是由真菌侵染引起 的。黄曲霉（Aspergillusflavus)是一种常见的霉菌，是子囊菌亚口（Ascomycotina)、曲 霉属（Aspergillus) -种常见的腐生型好氧真菌，不仅污染食品和饲料，而且可引起人类 和动物的多种疾病。黄曲霉的次生代谢产物黄曲霉毒素具有很强的毒性，研究报道其具有 致癌性、致突变、致崎性，降低免疫力，并可引起肝部损伤等危害。目前，防治黄霉菌及其毒 素污染的重要手段是使用抗生素及化学制剂，但随之导致耐药性细菌产生及抗生素残留等 问题，对食品安全造成重大影响，因此亟需开发新的手段来进行霉菌及其毒素污染的防治。 越来越多的研究发现，某些细菌，包括芽抱杆菌，可抑制霉菌的生长及其产毒，在防治黄曲 霉及其毒素污染方面显现出广阔的应用前景。许多研究发现，解淀粉芽抱杆菌炬acillus amyloliquefaciens)在生长过程中可W产生一系列抑制真菌和细菌活性的代谢物，已证实 的抑菌物质包括抑菌蛋白类、脂肤类抗生素、大环类醋类、肤类、聚酬化合物等，在抑制病原 菌、环境保护、动物生产等方面已显示出益生菌的用途。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽抱杆菌，可 减轻黑胡椒储藏中真菌及其毒素污染，而避免或减少使用化学抑菌剂和抗生素来抵抗霉菌 对黑胡椒的侵染，为开发无残留、安全、高效的食品保护剂提供新的手段，W延长食品的货 架期，提高食品安全性。
[0004] 本发明从市售黑胡椒体表分离出一株解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciensF1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中屯、（CGMCC)， 地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为： CGMCCNo.10942,保藏日期为2015年6月1日，菌种的分类命名为解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciensF1。
[0005] 本发明中的解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensFI具有W下生物学特 性：
[0006] (1)形态特征：经革兰氏染色后在生物显微镜下观察，菌体为紫色阳性，短杆状， 内生芽抱；透射电镜下可清晰地看到菌体呈典型的椿状杆菌，大小约30ym，单生，有鞭毛， 见图1;
[0007] (2)菌落特征；将筛选出的括抗菌FI先在营养肉汤培养基37°C培养2化，可观察 到有菌膜产生；后在营养肉汤固体培养基上进行划线培养，37°C培养4她后观察，菌落较大 约6. 0mm，表面膜状有權皱，侧面高凸起，幼龄菌挑起十分粘稠，随着培养时间的增加，菌落 分散成雪花状，灰白色不透明，见图1 ;
[000引 做生理生化特征；不产生嘲噪，V-P试验、甲基红试验均为阳性；氧化酶、接触酶、 淀粉酶、卵磯脂酶亦均为阳性；糖发酵试验结果为，不能利用甘露醇和乳糖，可发酵麦芽糖、 庶糖、葡萄糖但不产气；
[0009] (4)生长特性；对菌株F1进行生长特性研究，获得其最适生长温度为25-32°C，最 高可耐受45°C高温，最低可耐受20°C。可生长抑值为5. 0-8.0,最适生长抑为5. 5。耐盐 性试验表明，菌株可在低于10%氯化钢浓度的培养基中生长，最适生长盐浓度为5% ;
[0010] (5)抗真菌特性；抑制黑曲霉、白曲霉和寄生曲霉、黄曲霉等真菌生长及产毒；能 广抗真菌蛋白。
[0011] 本发明的有益效果是：
[0012] 芽解淀粉芽抱杆菌炬acillusamyloliquefaciens)在生长过程中可W产生一系 列抑制真菌和细菌活性的代谢物，已证实的抑菌物质包括抑菌蛋白类、脂肤类抗生素、大环 类醋类、肤类、聚酬化合物等，在抑制病原菌、环境保护、动物生产等方面已显示出益生菌的 用途，W芽解淀粉芽抱杆菌及其代谢产物研发新型抑菌剂和微生态剂对食品、饲料等加工、 储藏过程中真菌的生物防治具有潜在价值和广阔前景。
[0013] 本发明的解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensF1对黑曲霉、白曲霉和 寄生曲霉、黄曲霉具有较强抑制作用。本发明的菌株能产抗真菌蛋白，该蛋白具有较强的抑 稳定性和热稳定性，其能有效降低黄曲霉浸染黑胡椒模型中的黄曲霉毒素含量。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明菌株BacillusamyloliquefaciensF1的菌落形态及微观结构示意 图（注A，革兰氏染色；B，平板培养单菌落；图C和D，扫描电镜结果）。
[0015] 图2为本发明菌株BacillusamyloliquefaciensF1发酵上清液对毛霉的抑制作 用示意图。
[0016] 图3为本发明菌株BacillusamyloliquefaciensF1发酵液及其超滤液对黄曲霉 的抑制作用示意图。
[0017] 图4为本发明菌株BacillusamyloliquefaciensF1抗菌蛋白对黄曲霉菌丝生产 的影响示意图。
【具体实施方式】
[001引 实施例1BacillusamyloliquefaciensF1对霉菌生长的抑制作用
[0019] 霉菌培养及抱子悬液制作；将保存在PDA斜面培养基上霉菌接种到PDA平板，28°C 培养箱内培养4d后，加入一定量的无菌PBS缓冲液，用灭菌大枪头尖头轻刮培养基上的抱 子，然后将含有霉菌抱子和菌丝的混悬液通过灭菌八层纱布的藍盖瓶中W过滤掉霉菌菌 丝，祸旋震荡，10倍稀释法分别稀释10、100、1000倍后，血球计数板计数，然后将计数好的 霉菌抱子原液用无菌PBS缓冲液统一调整至lO5个/mL，4°C冰箱贬藏备用。
[0020] 抑菌率测定；将分离并保种的BacillusamyloliquefaciensF1，4°C解冻，吸取 100yL菌液于5血营养肉汤或MRS肉汤中培养活化，2化后取菌液600化/min离屯、lOmin， 0.22ym阳S水系滤膜过滤除菌收集上清液。吸取ImL无菌上清液倾注至无菌平板内，倒 入lOmLPDA培养基轻轻混匀，待培养基冷却凝固，用直径为6mm打孔器在中央打孔，向孔中 注入20yL浓度为104个/mL的霉菌抱子悬液，空白培养基代替上清液作为对照，30°C培养 3d后测霉菌直径，每组=个平行，W抑菌率（％ )为括抗细菌上清液的抑菌效果，抑菌率的 计算公式为；抑菌率（％ )=(对照组直径一试验组直径）X100/对照组直径。
[0021] 在上述测试条件下，BacillusamyloliquefaciensF1发酵液对黄曲霉、毛霉、黑 曲霉、和寄生曲霉的抑菌率分别达到75. 2 %、62. 8%、66. 3%和14. 3%。其中，Bacillus amyloliquefaciensF1发酵液对毛霉的抑菌效果见图2。
[0022] 实施例2BacillusamyloliquefaciensF1发酵液及其超滤液的抑菌特性
[0023] 分别选取膜截留分子量100ku、30ku和3ku的超滤膜对菌株F1发酵上清液进行超 滤，各部分超滤液的抑菌活性如图3所示，lOOku滤过液的抑菌性略高于原上清液的抑菌活 性；30ku滤过液和3ku滤过液的抑菌活性分别下降65. 31 %和80. 61 %。综上，菌株F1所 产抗真菌物质分子量范围在30ku~lOOku。为进一步证实该物质是否为蛋白类物质，分别 选用碱性蛋白酶、膜蛋白酶和蛋白酶K，W菌株F1超滤液（30ku~lOOku)为底物进行酶解 后检测其抑菌活性。经过=种蛋白酶处理后，超滤液（30ku~lOOku)的抑菌活性均出现不 同程度的下降，其中膜蛋白酶处理后的超滤液的抑菌活性下降了 70%，结果表明，抗菌超滤 液对蛋白酶较为敏感，初步确定30ku~lOOku超滤液中含有能抑制黄曲霉的蛋白类抗菌物 质。
[0024] 在温度50°C-70 °C范围内，抗菌超滤液对黄曲霉的抑菌活性变化不显著 (P> 0. 05);当抗菌超滤液温度高于70°C时，随着温度的升高