利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基。该培养基的组成成分为每升蒸馏水中包含有：葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麦芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氢钾0.4-0.6g/L、七水硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化铁0.004-0.006g/L，将上述组分以蒸馏水溶解，定容至1L，再以NaOH调节pH值至6.5-7.0，然后在121℃下灭菌15-30分钟，灭菌后即得所需培养基。本发明的培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，能显著提高海洋印尼红藻共生真菌Daldiniaeschscholzii生产免疫抑制化合物DalesconolA和DalesconolB的产量。
【专利说明】利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学领域，具体涉及用于生产免疫抑制化合物的培养基【技术领域】，更具体地，涉及利用海洋印尼红藻共生真菌Daldinia eschscholzii生产免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B的方法及其所用培养基。
【背景技术】
[0002]海洋微生物是生物功能天然产物的重要来源之一，从海洋中寻找天然活性物质正在成为新药开发的研究热点。海洋生物生活在高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部的高温和高盐等环境中,造成了海洋微生物的多样性和特殊性。海洋微生物由于适应了海洋环境，有了新的特异性，能产生陆栖微生物所不能产生的结构新颖、作用特殊的活性物质，这些活性物质将极大地克服机体的抗药性，同时为新药研发提供新的先导化合物，可以作为重要的海洋药物资源。
[0003]南京大学谭仁祥教授从海洋印尼红藻(CraciJaria sp.5K?_7)分离得到了海洋印尼红藻共生真菌escAscAohii，其属于光轮层炭壳菌。该菌经过液体或固体发酵可产生多种代谢物质。Dalesconol A (简称DA)和Dalesconol B (简称DB)是其产生的一种聚酮类次级代谢物，其体外的T细胞增殖实验表明DA和DB具有显著的免疫抑制效应(IC50:
0.16~0.58 μ g/mL)，同目前临床上使用最多的环孢素A相近(IC5tl: 0.06 μ g/mL)，而且相较于环孢素A，DA和DB具 有选择性更广、副作用更小的优点，是一种具有良好前景的免疫抑制候选药物。
[0004]然而，化合物DA和DB在初始环境下的产率相当低，已成为制约DA和DB用于临床前研究的瓶颈。因此需要通过优化其培养环境来使得化合物DA和DB获得稳定的高产。但微生物发酵是一个极其复杂的生物过程，涉及到许多相互影响的因素，产物生物合成水平受到很多方面的影响，其中适宜的培养基是微生物发酵的一个关键性因素。因此，针对该菌种的培养基进行优化显得十分重要。
[0005]目前比较成熟的优化培养基的方法有单因素实验、Plackett-Burman (筛选试验设计，简称PB)设计、正交实验、响应面设计等。
[0006]其中，Plackett-Burman设计,可对多个不同因子对响应值的显著性进行分析,从而找出对发酵产量或细胞生长最为重要的培养基组分，该方法分别对每个因子取高(+1)和低(-1 )两个水平，通过每个因子两水平之间的差异与整体差异之间的统计分析来确定各因子对相应变量的显著性。该方法可大大提高筛选效率，能以最少的试验次数使因素的主效果得到尽可能精确的估计。
[0007]响应面设计方法由Box-Wilson方法发展而来的，它是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过响应面和等高线分析，能够精确地研究各因子与响应变量之间的关系，优化出最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面法是一种适用性强的实验设计方法，包括实验设计、建模及寻求因子水平最佳操作条件等功能，显示出了其他方法所不具备的优点。该方法不但具备试验次数少，周期短、精度高等优点，而且可以对各因子水平及其交互作用进行优化和评价，可快速有效的确定多因子系统的最佳条件。
[0008]因此，通过联用PB设计和响应面设计，可以通过摇瓶实验确定重要因素，再针对重要因素得到最佳的组分水平，从而可大大加快获得最佳的培养基组成。
【发明内容】
[0009]本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B深入研究的瓶颈问题,提供一种用于发酵海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii生产免疫抑制剂Dalesconol A和Dalesconol B的培养基及其制备方法,及使用该培养基发酵生产Dalesconol A和Dalesconol B的方法。该培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，而使用该培养基发酵海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii 生产免疫抑制剂 Dalesconol A 和 Dalesconol B,能显著提高 Dalesconol A和Dalesconol B 的产量。
[0010]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种用于发酵培养海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基，其组成成分为每升蒸馏水中包含有:葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麦芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氢钾 0.4-0.6g/L、七水硫酸镁 0.4-0.6g/L、氯化铁 0.004-0.006g/L。
[0011]作为本发明的优选方案之一，所述培养基的组成成分为每升蒸馏水中包含有:葡萄糖22.98g/L、尿素1.48g/L、麦芽浸膏37.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化铁0.005g/L。
[0012]一种用于发酵培养海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基之制备方法，该制备方法的步骤为:
将葡萄糖、尿素、麦芽浸膏、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化铁加入蒸馏水中定容至1L，使上述成分在培养基中的终浓度分别为11.6-28.4g/L、0.87-2.13g/L、17.39-42.61g/L、
0.4-0.6g/L、0.4-0.6g/L、0.004-0.006g/L，再以 NaOH 调节 pH 值至 6.5-7.0，然后在 121 °C下灭菌15-30分钟，灭菌后即得海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基。
[0013]一种利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法，该方法包括如下步骤:
a.将冷冻保存的海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii解冻后,在固体平板培养基中央进行点样并活化培养7-10天，获得新鲜固体平板培养基，固体平板培养基每隔30天重新活化一次；
b.从新鲜的海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii的固体平板培养基中挖取I块琼脂块，接种至种子培养基中发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；
c.取所述新鲜种子液，按5-20%(v/v)的接种量接入权利要求1和2任一项所述培养基，以28±2° C、180±20 rpm摇床振荡培养6_8天后，获得发酵液；以及
d.取所述发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得免疫抑制化合物DalesconolA和Dalesconol B。
[0014]其中，所述海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii是一种光轮层炭壳菌。
[0015]与现有技术相比，本发明提供的一种利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法及其培养基的主要优点如下:本发明的培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，能显著提高海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii生产免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B 的产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为基于Plackett-Burman实验结果，以葡萄糖(Xl)为确定最优区域的中心点而进行的单因素的实验结果图；
图2为基于Plackett-Burman实验结果，以尿素(X2)为确定最优区域的中心点而进行的单因素的实验结果图；
图3为基于Plackett-Burman实验结果，以麦芽浸膏(X3)为确定最优区域的中心点而进行的单因素的实验结果图；
图4-6为利用Design Expert 8.0数据处理软件,建立回归方程后获得的三个因子葡萄糖、尿素、麦芽浸膏对Dalesconol A和Dalesconol B产量的响应面分析图。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
[0018]本发明所用菌种、培养基为:
菌种:海洋真菌eschscholzii是由南京大学谭仁祥教授课题组从海洋印尼HiGreicileiriei sp.S GR-1)中分离的一株能够生产免疫抑制化合物的丝状真菌,鉴定此菌为光轮层炭壳菌属。
[0019]培养基制备:葡萄糖20g、尿素lg、麦芽浸膏20g、磷酸二氢钾0.5g、七水硫酸镁
0.5g、氯化铁0.005g，琼脂20g (固体培养基)，加入蒸馏水中定容至1L，再以NaOH调节pH值至6.5-7.0，然后在121°C下灭菌15-30分钟，灭菌后即得海洋真菌生产免疫抑制化合物
的培养基。
[0020]以下给出发酵操作过程以及Dalesconol A和Dalesconol B的检测方法:
I)发酵操作过程
将-4°C保存的海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii解冻后,用接种针在固体平板培养基中央进行点样，置于28°C恒温培养箱，活化培养7-10天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4°C冰箱保存。然后用接种铲从新鲜的海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii的固体平板培养基中挖取I块5X5 mm琼脂块,接种至装有400 ml种子培养基的100ml摇瓶中，以28。C、180 rpm摇床发酵培养3_4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入所述发酵培养基，以28° C、180 rpm摇床振荡培养6_8天，获得发酵液。
[0021]2) Dalesconol A 和 Dalesconol B 的产量检测
取50 ml所获发酵液于250 ml锥形瓶中，加入50 ml乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28°C和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取I小时，并重复三次，然后取3 ml上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用I ml无水甲醇溶解；在相对离心力为13780Xg的条件下离心3分钟后，取500 μ I上清液，用高效液相色谱法测定Dalesconol A和Dalesconol B的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中DalesconolA和Dalesconol B的实际含量。
[0022]本实施例的试验设计、数据分析及检测结果如下:
1.Plackett-Burman 试验设计
Plackett-Burman设计,可对多个不同因子对响应值的显著性进行分析，从而找出对发酵产量或细胞生长最为重要的培养基组分，分别对每个因子取高(+1)和低(-1 )两个水平，通过每个因子两水平之间的差异与整体差异之间的统计分析来确定各因子对相应变量的显著性。通过Design Expert 8.0数据处理软件设计,本实验选取影响因素6个,选用了N=12的PB试验设计表。各参数所代表的因素及水平见表格(参见表1和表2)。表1中X1,X2, X3，X4，X5和X6分别代表葡萄糖、尿素、麦芽浸膏、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化铁；￥代表免疫抑制化合物Dalesconol A (以下简称DA)和Dalesconol B (以下简称DB)的产量和。
[0023]表1 Placket-Burman设计实验结果
【权利要求】
1.一种用于发酵培养海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基，其特征在于，所述培养基的组成成分为每升蒸馏水中包含有:葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麦芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氢钾0.4-0.6g/L、七水硫酸镁0.4-0.6g/L、氯化铁0.004-0.006g/L。
2.根据权利要求1所述的用于发酵培养海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基，其特征在于，所述培养基的组成成分为每升蒸馏水中包含有:葡萄糖22.98g/L、尿素1.48g/L、麦芽浸膏37.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化铁0.005g/L。
3.一种用于发酵培养海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基之制备方法，其特征在于，该制备方法的步骤为: 将葡萄糖、尿素、麦芽浸膏、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化铁加入蒸馏水中定容至1L，使上述成分在培养基中的终浓度分别为11.6-28.4g/L、0.87-2.13g/L、17.39-42.61g/L、0.4-0.6g/L、0.4-0.6g/L、0.004-0.006g/L，再以 NaOH 调节 pH 值至 6.5-7.0，然后在 121。。下灭菌15-30分钟，灭菌后即得海洋真菌生产免疫抑制化合物的培养基。
4.一种利用海洋真菌生产免疫抑制化 合物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: a.将冷冻保存的海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii解冻后,在固体平板培养基中央进行点样并活化培养7-10天，获得新鲜固体平板培养基，固体平板培养基每隔30天重新活化一次； b.从新鲜的海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii的固体平板培养基中挖取I块琼脂块，接种至种子培养基中发酵培养3-4天，获得新鲜种子液； c.取所述新鲜种子液，按5-20%(v/v)的接种量接入权利要求1和2任一项所述培养基，以28±2° C、180±20 rpm摇床振荡培养6-8天后，获得发酵液；以及 d.取所述发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得免疫抑制化合物DalesconolA和Dalesconol B。
5.根据权利要求4所述的利用海洋真菌生产免疫抑制化合物的方法，其特征在于，所述海洋印尼红藻共生真菌eschscholzii是一种光轮层炭壳菌。
【文档编号】C12P7/26GK104031948SQ201410299672
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】卢艳花, 潘正骅, 谭仁祥, 焦瑞华, 赵国琰 申请人:华东理工大学, 南京大学