一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方 法。
【背景技术】
[0002] 血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管 舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及 其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。从实验用豚鼠颈总动脉分离得到的内皮细胞 (endothelialcell,EC)是广泛用于实验研究的血管内皮细胞。
[0003]内皮细胞体外生长能力较差，原代培养不易成功。W往主要是采用机械分离法和 组织块移植法。将厮静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有巧龙筛的分离管，但 该一方法很难掌握力度，用力太轻，取得的细胞数量很少；用力太重，易混杂其他血管壁细 胞如成纤维细胞等，而且此方法易损伤内皮细胞。近几年来内皮细胞分离已逐渐被酶消化 法取代，此法获得的细胞较纯，且能较好地保持其生物活性，但是膜酶对细胞膜有较强的分 解能力，能够破坏细胞的完整性，影响细胞的活力，并且消化所得的内皮细胞中，可能含有 大量的成纤维细胞，对后续实验产生影响，胶原酶消化时间长，细胞解离不充分且损伤大， 另外所得细胞极少，培养时细胞活性差。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和 培养方法，不仅成活率高、对细胞损害低，而且经济实用、简单易行，适于工厂等大规模生 产。
[0005]本发明为解决上述问题所采取的技术方案是；一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离 和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的豚鼠，在无菌条件下切取豚鼠的颈总动脉并除去血污，备用； 2) 将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将 颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化液的容器内，使颈总动脉的 内膜与容器中的消化液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，之后将装有颈总动脉的容器 封闭，并转入温度为4°C的环境中静置8-12h; 3) 步骤2)处理后，向容器中加入胎牛血清W终止消化反应，收集容器中的液体，并放 入转速为1500r/min的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总 动脉内皮细胞放入邸M培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、C〇2体积浓度为 5%的C〇2培养箱中培养，之后进行传代培养即可。
[0006]所述豚鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、步骤3)分离得到的豚鼠颈总动脉原代内皮细胞转入邸M培养基中培养，每隔2-3天 换一次培养基，培养4-6天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； B、 将豚鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液， 并加入胎牛血清W终止消化反应； C、 将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离屯、管中，在转速为1500rpm的离 屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMHM培基中培养即可。
[0007]步骤2)所述消化的温度为4°C、时间8-12小时。
[000引步骤2)所述的消化液由胶原麵I、弹性蛋白酶、膜酶按8:1:1的体积比混合而成。
[0009] 步骤B中所述的消化液是将质量浓度为0. 125 %的膜酶和质量浓度为0.02 %的 邸TA按6:1的体积比混合并揽拌均匀后制得。
[0010] 有益效果 本发明采用豚鼠为材料，材料来源广泛，方便易得。采用低温膜酶消化法分离得到内皮 原代细胞，克服了膜酶对内皮细胞损伤较大的缺点，并选择4°c膜酶消化过夜，消化时间充 分，对材料的利用度较高，减少了杂细胞的干扰，分离出的内皮细胞活性强，数量多。此方法 经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实验模型细胞，为进一步研究内皮细胞在提高 屯、血管疾病药物药效方面提供帮助。此方法经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实 验模型细胞，为进一步研究内皮细胞在提高屯、血管疾病药物药效方面提供帮助。
【附图说明】
[0011] 图1为内皮细胞培养过程中形态观察结果； 图2为内皮细胞VIII因子免疫组化结果； 图3为丹参注射液对血管内皮细胞作用的MIT检测存活率图。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，本发明的保护范围不限于下述实施 例。
[0013] 一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的豚鼠，在无菌条件下切取豚鼠的颈总动脉并除去血污，备用； 2) 将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将 颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化液的容器内，使颈总动脉的 内膜与容器中的消化液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，之后将装有颈总动脉的容器 封闭，并转入温度为4°C的环境中静置8-12h; 3) 步骤2)处理后，向容器中加入胎牛血清W终止消化反应，收集容器中的液体，并放 入转速为1500r/min的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总 动脉内皮细胞放入EBM培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、C〇2体积浓度为 5%的C〇2培养箱中培养，之后进行传代培养即可。
[0014] 所述豚鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、 步骤3)分离得到的豚鼠颈总动脉原代内皮细胞转入邸M培养基中培养，每隔2-3天 换一次培养基，培养4-6天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； B、 将豚鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液， 并加入胎牛血清W终止消化反应； c、将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离屯、管中，在转速为1500rpm的离 屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMHM培基中培养即可。
[0015]步骤2)所述消化的温度为4°C、时间8-12h。
[0016] 步骤2)所述的消化液由胶原酶n、弹性蛋白酶、膜酶按8:1:1的体积比混合而成。
[0017] 步骤B中所述的消化液是将质量浓度为0. 125 %的膜酶和质量浓度为0.02 %的 邸TA按6:1的体积比混合并揽拌均匀后制得。
[001引 实施例1 一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的豚鼠，在无菌条件下切取豚鼠的颈总动脉并除去血污，备用； 2) 将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将 颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化液的容器内，使颈总动脉的 内膜与容器中的消化液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，之后将装有颈总动脉的容器 封闭，并转入温度为4°C的环境中静置她； 3) 步骤2)处理后，向容器中加入胎牛血清W终止消化反应，收集容器中的液体，并放 入转速为1500r/min的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总 动脉内皮细胞放入EBM培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、C02体积浓度为 5%的C02培养箱中培养，之后进行传代培养即可。
[0019] 所述豚鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、 步骤3)分离得到的豚鼠颈总动脉原代内皮细胞转入邸M培养基中培养，每隔2天换 一次培养基，培养4天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； B、 将豚鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液， 并加入胎牛血清W终止消化反应； C、 将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离屯、管中，在转速为1500rpm的离 屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMHM培基中培养即可。
[0020] 步骤2 )所述消化的温度为4°C、时间8小时。
[002。 步骤2)所述的消化液由胶原酶II、弹性蛋白酶、膜酶按8:1:1的体积比混合而成。
[0022] 步骤B中所述的消化液是将质量浓度为0. 125 %的膜酶和质量浓度为0.02 %的 邸TA按6:1的体积比混合并揽拌均匀后制得。
[002引 实施例2 一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的豚鼠，在无菌条件下切取豚鼠的颈总动脉并除去血污，备用； 2) 将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将 颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化液的容器内，使颈总动脉的 内膜与容器中的消化液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，之后将装有颈总动脉的容器 封闭，并转入温度为4°C的环境中静置12h; 3) 步骤2)处理后，向容器中加入胎牛血清W终止消化反应，收集容器中的液体，并放 入转速为1500r/min的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总 动脉内皮细胞放入邸M培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、C02体积浓度为 5%的C02培养箱中培养，之后进行传代培养即可。
[0024] 所述豚鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、 步骤3)分