离得到的豚鼠颈总动脉原代内皮细胞转入邸M培养基中培养，每隔3天换 一次培养基，培养6天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； B、 将豚鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液， 并加入胎牛血清W终止消化反应； C、 将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离屯、管中，在转速为1500rpm的离 屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMHM培基中培养即可。
[00巧]步骤2 )所述消化的温度为4°C、时间12小时。
[0026]步骤2)所述的消化液由胶原酶II、弹性蛋白酶、膜酶按8:1:1的体积比混合而成。
[0027] 步骤B中所述的消化液是将质量浓度为0. 125 %的膜酶和质量浓度为0.02 %的 邸TA按6:1的体积比混合并揽拌均匀后制得。
[0028]试验 1 (1)购买成年豚鼠。无菌条件下取体重为l〇〇-150g左右的豚鼠的颈总动脉，并在PBS缓冲液中洗去血污。将颈总动脉切成3-5 cm的长段，放入盛有3-5ml灭菌过的PBS溶液的 培养皿中剥离外膜。另取一培养皿，加入2-3 ml消化液。将颈总动脉纵行剪开，使内膜朝 下平摊于培养皿上，使内膜与由胶原酶H、弹性蛋白酶、膜酶按8:1:1的体积比混合而成的 消化液充分接触。将培养皿用封口膜密封好，放入冰箱4°C消化过夜。消化完后，收集消化 液，加入2-4ml胎牛血清终止消化。将收集液离屯、（1500转/分）3分钟。倒去上清，加入 1-2 ml内皮细胞培养基（M199培养基含10%体积浓度的胎牛血清谷氨酷胺及碱性成纤 维细胞生长因子，北京塞默飞世尔生物公司生产)，用移液器吹散细胞，将所有液体转入培 养瓶中，于C〇2培养箱中（C〇2浓度为5%)，37 °C培养。内皮细胞在C02培养箱37 °C培养24小 时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入2-4ml内 皮细胞培养基。W后每2-3天换一次培养基，一般培养4-6天，细胞可长满至80-90 %单 层，正常的内皮细胞长满后如同卵石状，此时可W传代。
[0029] (2)内皮细胞在CA培养箱37 °C培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶 液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入2-4ml内皮细胞培养基。W后每2-3天换一次 培养基，一般培养4-6天，细胞可长满至80-90 %单层，正常的内皮细胞长满后如同卵石 状，此时可W传代。
[0030] (3)倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0. 125%膜 酶+0. 2%邸TA，按6:1比例混合）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，弃去消化 液，即加入l-2ml胎牛血清终止反应。用移液器将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到 一个15ml无菌离屯、管中，1500转/分，离屯、3分钟。倒掉上清，加入2-4ml内皮细胞培养 基，用移液器吹打均匀后，移入培养瓶，即得到传代细胞。
[003U试验 2. (1)将传至第3代的内皮细胞接种于96孔板中，密度104/孔。每孔中加入lOOulM199 培养基，正常培养1化后，换成无血清的M199培养基继续培养12h，使细胞同步化。弃去培 养基，加入不同浓度的丹参注射液保护1化后，换成含120ug/mlOx-LDL的无血清M199培 养基，每孔lOOul，并设置正常对照组，每组=个平行复孔。继续培养2化后，收集上清，=孔 富集于一管中。每孔加入无血清培养基，并加入lOulMIT用酶标仪在490nm处测定吸光值 (0D490)。W对照组细胞活力为100%，并设置DMS0空白组，其余各组细胞活力按下式计算； 细胞活力（％)=(处理组0D490-空白组0D490) / (对照组0D490-空白组0D490)X100% (2)结果 人源氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)具有一定的细胞毒性，对内皮细胞有一定的损伤。Ox-LDL脂质过氧化物能使动脉内皮细胞坏死，并增强脂质蛋白对细胞壁的通透性。因此采 用化-LDL刺激内皮细胞，进而探究丹参对内皮细胞的保护作用。图3显示，处理组化-LDL 刺激内皮细胞，使细胞活力显著下降；丹参给药组与处理组相比活力显著提高，并呈现浓 度依赖，当丹参注射液浓度为luM时，细胞活力最强，说明丹参对内皮细胞存在明显的保护 作用。
[0032]试验 3. (1)将生长状态良好的内皮细胞接种于6孔板，密度1〇7 /孔。分为对照组、氧化型低 密度脂蛋白（100mg/L)组、氧化型低密度脂蛋白（100mg/L) +=走总皂巧（终质量浓度 分别为200，100,50 111肖/1)组，分别作用1211、2化。
[0033] (2)弃去培养液，膜蛋白酶消化，PBS冲洗后收集细胞，150化/min离屯、去上清液， 加入羊抗人血管细胞黏附分子1抗体稀释液（1 : 200)重悬细胞，4°C放置比后，用10倍 于抗体细胞悬液量的磯酸盐缓冲液重悬细胞，离屯、去上清液，加入巧光素标记的抗鼠抗体 稀释液（1 : 100)，4°C放置比。
[0034] (3)用10倍于抗体细胞悬液量的磯酸盐缓冲液重悬细胞，离屯、去上清液，0. 5血 PBS重悬细胞，流式细胞仪检测其平均巧光强度。结果见表1。
[0035] (4)结果；实验结果发现，氧化型低密度脂蛋白作用于内皮细胞，造成内皮细胞损 伤并抑制细胞活性，而不同浓度的=走总皂巧可括抗氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞的损 伤作用。同时，氧化型低密度脂蛋白能明显诱导增加或上调血管内皮细胞的血管细胞黏附 分子1的蛋白表达，并随氧化型低密度脂蛋白作用时间的延长而增加，血管内皮细胞的血 管细胞黏附分子1的蛋白表达明显增加。=走总皂巧能明显降低或抑制内皮细胞中血管 细胞黏附分子1的蛋白表达，该种作用随着剂量的增加而增强，表明=走总皂巧可有效地 保护血管内皮细胞免受氧化型低密度脂蛋白的损害，对预防和治疗动脉粥样硬化有重要意 义。
[0036] 表1 S走总皂巧对血管细胞黏附分子1蛋白表达的影响
【主权项】
1. 一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 选取重为100-150g的豚鼠，在无菌条件下切取豚鼠的颈总动脉并除去血污，备用； 2) 将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将 颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化液的容器内，使颈总动脉的 内膜与容器中的消化液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，之后将装有颈总动脉的容器 封闭，并转入温度为4°C的环境中静置8-12h; 3) 步骤2)处理后，向容器中加入胎牛血清以终止消化反应，收集容器中的液体，并放 入转速为1500r/min的离心机中离心3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总 动脉内皮细胞放入EBM培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、C02体积浓度为 5%的C02培养箱中培养，之后进行传代培养即可。2. 根据权利要求1所述的一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，其特征在 于：所述豚鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了以下步骤： A、 步骤3)分离得到的豚鼠颈总动脉原代内皮细胞转入EBM培养基中培养，每隔2-3天 换一次培养基，培养4-6天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； B、 将豚鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液， 并加入胎牛血清以终止消化反应； C、 将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离心管中，在转速为1500rpm的离 心机中离心3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMEM培基中培养即可。3. 根据权利要求1所述的一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，其特征在 于：步骤2)所述消化的温度为4°C、时间8-12小时。4. 根据权利要求1所述的一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，其特征在 于：步骤2)所述的消化液由胶原酶II、弹性蛋白酶、胰酶按8:1:1的体积比混合而成。5. 根据权利要求2所述的一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，其特征在 于：步骤B中所述的消化液是将质量浓度为0. 125%的胰酶和质量浓度为0. 02%的EDTA按 6:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。
【专利摘要】本发明公开一种豚鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：1）在无菌条件下切取豚鼠的颈总动脉；2）将颈总动脉切割成长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化液的容器内，使颈总动脉的内膜与容器中的消化液充分接触，之后将装有颈总动脉的容器封闭，并转入温度为4℃的环境中静置；3）向容器中加入胎牛血清，收集容器中的液体，并放入离心机中离心，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总动脉内皮细胞放入EBM培养基中，达到对数期后转入培养箱中培养，之后进行传代培养。本发明不仅成活率高、对细胞损害低，且经济实用、简单易行，适于大规模生产。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN104988113
【申请号】CN201510432669
【发明人】王燕华, 武福华, 石建州, 郭昭涵, 李银河, 夏敏
【申请人】南阳师范学院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月22日