Pcsk9蛋白的d374y突变体在抑制肝脏细胞胆固醇流出中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种PCSK9蛋白的D374Y突变体在抑制肝脏细胞 胆固醇流出中的应用。
【背景技术】
[0002] 前蛋白转化酶枯草溶菌素 9(proproteinconvertasesubtilisin-l;Lke/ kexintype9，PCS脚）是常染色体显性遗传高胆固醇血症ADH(autosomaldominant hypercholesterolemia)的主效基因。PCSK9在肝脏的细胞的功能主要表现为对低密度脂 蛋白受体（low-densitylipoproteinrec巧tor,LDLR)的翻译后调控作用；PCSK9分泌蛋 白能与肝细胞膜上LDLR相结合，介导PCSK9-LDLR复合体的胞内溶酶体降解过程，而不影响 LDLR的内吞作用和载脂蛋白B(apolipoproteinB，apoB)的合成，因此PCSK9的高表达或 功能获得性突变与动脉粥样硬化疾病有直接的关系。
[0003] 目前的研究报道中未见PCSK9对肝脏细胞胆固醇外流影响的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种PCSK9蛋白的D374Y突变体在抑制肝脏细胞胆固醇 流出中的应用。
[0005] 所述PCSK9蛋白的D374Y突变体具体为序列表中序列1所示蛋白质；所述应用具 体为在如下任一中的应用：
[0006] (al)制备抑制肝脏细胞胆固醇流出的产品；
[0007] (a2)抑制肝脏细胞胆固醇流出；
[000引 （a3)下调ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋白表达量。
[0009] 编码序列表中序列1所示蛋白质的基因（即所述PCSK9蛋白的D374Y突变体的编 码基因）在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0010] (al)制备抑制肝脏细胞胆固醇流出的产品；
[0011] (a。抑制肝脏细胞胆固醇流出；
[001引 （a3)下调ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋白表达量。
[0013] 含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用 也属于本发明的保护范围：
[0014] (al)制备抑制肝脏细胞胆固醇流出的产品；
[0015] (a2)抑制肝脏细胞胆固醇流出；
[0016] (a3)下调ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋白表达量。
[0017] 上述（a2)所示的应用为非疾病诊断性应用。
[0018] 本发明的另一个目的是提供一种抑制肝脏细胞胆固醇流出的产品。
[0019] 本发明所提供的抑制肝脏细胞胆固醇流出和/或下调ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋 白表达量的产品，其活性成分可为如下中至少一种：
[0020] (a)序列表中序列1所示蛋白质；
[0021] 化）编码序列表中序列1所不蛋白质的基因；
[0022] (C)含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
[0023] 所述产品可为试剂盒。
[0024] W上所述基因可为如下中任一种：
[00幼 （1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[002引 似在严格条件下与（1)限定的DNA分子杂交且编码序列表中序列1所示蛋白质 的DNA分子；
[0027] 做与（1)或似限定的DNA序列具有90%W上同源性且编码序列表中序列1所 示蛋白质的DNA分子。
[002引上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0029] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，W及转录终止序列组 成。
[0030] 在本发明中，所述重组载体为重组表达载体。所述重组表达载体具体为在 PCDNA3. 1(+)载体的多克隆位点处插入所述基因（序列2)后得到的重组质粒。所述多克隆 位点具体为化ul和化〇1。
[0031] 所述转基因细胞系为非繁殖材料。
[0032] 在本发明中，所述肝脏细胞为人源肝脏细胞，可为肝癌细胞，具体为化pG2细胞。
[0033] 在本发明中，所述抑制肝脏细胞胆固醇流出是通过下调ABCA1蛋白（序列5)和/ 或ABCG1蛋白（序列6)的表达量来实现的。
[0034] 本发明还有一个目的在于提供一种降低肝脏细胞胆固醇流出率的方法。
[0035] 本发明所提供的降低肝脏细胞胆固醇流出率的方法，具体可包括如下步骤；向目 的肝脏细胞中导入编码序列表中序列1所示蛋白质的基因，得到表达所述基因的重组肝脏 细胞；所述重组肝脏细胞的胆固醇流出率与所述目的肝脏细胞的胆固醇流出率相比降低。
[0036] 所述方法为非疾病诊断性方法。
[0037] 所述基因可为如下中任一种：
[00測 （1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[003引 似在严格条件下与（1)限定的DNA分子杂交且编码序列表中序列1所示蛋白质 的DNA分子；
[0040] 做与（1)或似限定的DNA序列具有90%W上同源性且编码序列表中序列1所 示蛋白质的DNA分子。
[0041] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0042] 其中，所述基因是通过重组表达载体的形式导入所述目的肝脏细胞中的。所述重 组表达载体具体可为在PCDNA3. 1 (+)载体的多克隆位点化ul和化〇1处插入所述基因（序 列2)后得到的重组质粒。
[004引在本发明中，所述肝脏细胞为人源肝脏细胞，可为肝癌细胞，具体为HepG2细胞。
[0044] 本发明利用脂质体转染的过表达载体结合G418药物筛选实现PCSK9蛋白的D374Y 突变体在化pG2细胞中的稳定高表达，并对该细胞的胆固醇流出能力进行了检测。实验证 明，PCSK9蛋白的D374Y突变体过表达显著抑制HepG2细胞的胆固醇流出率；PCSK9蛋白的 D374Y突变体对肝脏细胞的胆固醇流出的抑制是通过下调ABCA1蛋白、ABCG1蛋白的表达量 起作用的。本发明对研究肝脏细胞胆固醇代谢具有重要意义。
【附图说明】
[0045] 图1为人PCSK9基因在化pG2细胞中的过表达检测。A为PCSK9过表达载体在 化pG2细胞中的翻译水平检测；PCDNA3. 1 (+)-D374Y表示连接PCS脚-D374Y突变体序列的过 表达质粒；control表示PCDNA3. 1 (+)空载体对照组；内参为GAPDH。B为化pG2细胞培养 液中PCSK9浓度的化ISA检测。*林，P< 0. 001。
[0046] 图2为PCSK9过表达对化pG2胆固醇转运的影响。A为22-NBD-胆固醇解育时 间和HepG2巧光强度的关系（PCDNA3. 1 (+)-NC组），其中control指的是化。B为皿L处 理时间与胆固醇流出的关系（PCDNA3. 1 (+)-NC组）。C为皿L浓度与胆固醇流出的关系 (PCDNA3. 1 (+) -NC组），其中control指的是0yg。D和E为PCSK9过表达对化pG2胆固醇 转运的影响。D是胆固醇流出率的柱状统计图；E为细胞流式峰图，指示胆固醇流出过程中 平均巧光强度曲线的偏离幅度。线1表示化pG2背景巧光强度，线2表示22-NBD-胆固醇 解育化，即胆固醇流出起始时间点，线3表示继解育巧光胆固醇化后用皿L处理化，整个 实验过程为化。巧光强度指示细胞内巧光标记胆固醇的含量。F为PCSK9过表达对化pG2 胆固醇吸收能力的影响。"NC"为PCDNA3.l(+)-NC的缩写，叩374Y"为PCDNA3.l(+)-D374Y 的缩写。pcDNA3. 1 (+)-D374Y、pcDNA3. 1 (+)-NC分别表示连接PCS脚-D374Y突变体序列和 NC空白质粒。*，P< 0. 05, *林，P< 0. 001，林林，P< 0. 0001。
[0047] 图3为胆固醇转运相关蛋白的检测。PN、PD分别表示PCDNA3. 1空白载体、 PCDNA3.l(+)-D374Y。内参为e-actin。
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] HepG2细胞；中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中屯、产品，资源编号： 3111C0001CCC000035。记载于"王丛丛.ATF6在内质网应激引起的化pG2细胞自瞻与调亡 中作用机制的研究.中国农业大学，2014年博±论文"一文。
[0051] PCDNA3. 1(+)载体；lifetechnologies公司产品，货号为；V790-20。
[0052] MEM肥AA，DMEM，FBS，Tiypsin-EDTA，Glutamax，Pen-str巧，Sodiumpyruvate; Gibco;AmaxaBasicNucleofectorKit，Lonza;Anti_mouseIgG，HRP，Anti-rabbitIgG， HRP,anti-P-actin，anti-ABCGl,anti-ABCAl,anti-SR-BI;CST;anti-PCS脚；Circulex; HumanPCS脚ELISAKit;Cir州Lex;22-NBD-胆固醇；Lifetechnology。
[0053] 实施例1、人PCSK9基因D374Y突变体过表达载体的构建
[0054] 本发明设及人PCSK9基因D374Y突变体序列（Genebank;NM_174936,1120bp处的 G突变为T，使天冬氨酸密码子GAC突变为酪氨酸的密码子TAC)。PCSK9基因野生型的核巧 酸序列具体为序列表中序列4所示，编码序列表中序列3所示的野生型PCSK9蛋白。PCSK9 基因的D374Y突变体序列的核巧酸序列具体为序列表中序列2所示，编码序列表中序列1 所示的PCSK9蛋白的D374Y突变体。
[005引本实施例将PCSK9基因的D374Y突变体序列（序列2)插入到PCDNA3. 1 (+)载体 的多克隆位点化ul和化01之间构建成重组表达载体PCDNA3. 1 (+)-D374Y。
[0056] 重组载体的构建由苏州金唯智生物科技有限公司完成。对所得重组质粒进行测序 验证。将经测序表明在PCDNA3. 1 (+)载体的多克隆位点化ul和化〇1之间插入了序列表中 序列2所示DNA片段的重组质粒命名为PCDNA3. 1 (+)-D374Y。
[0057] 实施例2、人PCSK9基因D374Y突变体过表达载体在化pG2细胞中的正常翻译和分 泌
[0058] 为了验证PCSK9基因的D374Y突变体过表达载体的工作效率，将实施例1构建获 得的重组表达载体PCDNA3. 1 (+) -D3