一种pH值稳定的淋巴细胞培养基及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体设及一种抑值稳定的淋己细胞培养基及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。遗传 病设及的学科很多，包括妇产科学一不孕不育、优生优育、内分泌素乱；血液病学一慢性粒 细胞性白血病，急性粒细胞性白血病，骨髓增生异常综合征，急性淋己细胞性白血病等；儿 科学一出生缺陷；肿瘤学；内科学一放射病、染色体断裂综合征等，具有先天性、终生性和 家族性、病种多、发病率高等特点。临床常见的高血压、糖尿病、哮喘、癌症、忧郁症、老年痴 呆等与遗传有关。
[0003] 目前，对于遗传病的诊断主要采用的还是细胞遗传学的方法，即染色体核型分析。 染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色 体分带技术对某一生物的染色体进行分析，比较，排序，编号，是细胞遗传学研究的基本方 法，是研究物种演化、分类W及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手 段。染色体核型分析也是临床上广泛开展的对遗传病进行诊断的一种基本方法，经核型分 析后，可W根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的 基因才导致的该种疾病。因此染色体核型分析在遗传病的诊断和筛查上具有重要意义。
[0004] 染色体核型分析的原理和基本过程：利用PHA(植物血凝素）刺激成熟的淋己细胞 再次分裂；利用秋水仙素在细胞分裂中期破坏纺键丝，抑制细胞分裂，形成染色体的形态； 通过膜酶消化或缓冲液作用，将染色体显带，通过带纹和数目的分析判断染色体数目和结 构的情况。从W上原理可W看出，染色体核型分析技术的关键是培养出合格的淋己细胞。
[0005] 传统淋己细胞培养基由基础培养基（RP1640培养基）、抗菌素、小牛血清（或者胎 牛血清）、淋己细胞刺激因子、碳酸氨钢缓冲系统等组成。但是碳酸氨钢缓冲系统容易受环 境中二氧化碳的影响，随着保存时间的延长，抑值升高，不利于培养基的保存。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种抑值稳定的培养基；该培养基的 抑值不受环境中气体成分的影响，又能够稳定淋己细胞培养时的抑值；便于培养基长时间 保存。
[0007] 本发明的目的通过W下方案达到：
[0008]本发明的淋己细胞培养基由1640基础培养基、植物血球凝集素（PHA)、小牛血清 和甘油磯酸钢/4-哲己基嗽嗦己横酸（肥PE巧双缓冲系统组成；所述PHA的浓度为lOOmg/ L，所述甘油磯酸钢/肥阳S双缓冲系统的浓度为5-50mM，所述小牛血清的体积百分比为 20%。
[0009] 优选的，所述甘油磯酸钢/肥阳S双缓冲系统由磯酸缓冲液、甘油磯酸钢、4-哲己 基嗽嗦己横酸（肥阳巧组成，所述磯酸缓冲液含化2册〇4和KH2PO4。
[0010] 优选的，所述甘油磯酸钢的浓度为3g/l，所述4-哲己基嗽嗦己横酸（肥PE巧的浓 度为3g/l，所述Na2HP〇4的浓度为2g/l，所述KH2PO4的浓度为Ig/L。表1为本发明优选的 淋己细胞培养基各组分及浓度列表。
[0011] 表1
[0012]
[0013] 本发明还提供了一种制备上述培养基的方法，按如下操作进行；取如上述培养基 的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入超纯水定容，过滤除菌。
[0014] 本发明还提供了上述培养基在淋己细胞培养中的应用。
[001引本发明的抑值稳定的淋己细胞培养基，利用甘油磯酸钢/PBS缓冲系统，对细胞后 续培养没有影响，且能够稳定细胞抑值；此缓冲系统不受环境中二氧化碳W及其余气体成 分的影响，利于培养基的长期保存。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1;不同配方的培养基培养效果比较
[0017] 1、配制加入血清的基础培养基；10. 5g1640基础培养基，0. 1评HA，200ml小牛血 清，用超纯水定容至1L。
[0018]2、配制培养基1;取1份基础培养基，添加2g/LNaHO)3。
[0019] 3、配制培养基2 ;取1份基础培养基，添加2g/LNa2HP〇4,Ig/LK&PCV
[0020] 4、配制培养基3 ;取1份培养基2,添加9g/L甘油磯酸钢。
[0021] 5、配制培养基4 ;取1份培养基2,添加6g/L肥阳S。
[0022] 6、配制培养基5 ;取基础培养基2,添加3g/L甘油磯酸钢、3g/L肥阳S。
[0023] 7、W上培养基用盐酸/氨氧化钢溶液或者冲入二氧化碳调节抑至7.2。
[0024] 8、0. 22Um滤膜过滤除菌。
[00巧]9、外周血淋己细胞培养、染色体制片；
[0026] (1)采血；在采血者的肘部用舰棉签消毒皮肤两遍，取1ml-次性灭菌注射器，从 肘部静脉采血1ml。
[0027] (2)培养；在酒精灯上将针头直接从橡皮塞（已用舰消毒）上插入，将血液缓缓滴 入装有5ml1640培养基的瓶内，每瓶0. 5ml，轻轻摇动，置于37°C温箱中培养68-72小时。 [002引 （3)秋水仙素处理：终止培养前4小时，在一瓶培养瓶内加入25ul/ml秋水仙 素0. 05ml，轻轻摇匀，继续培养4小时。2小时后在另一培养瓶内加入80ul/ml秋水仙素 0. 05ml，轻轻摇匀，继续培养2小时。该样使细胞分裂停止在中期。
[002引（4)离屯、：在室温下将培养物移入10ml刻度离屯、管内，1500转/分离屯、10分钟， 吸去上清液，留底层离屯、沉淀物。
[0030] 妨低渗处理；加入8ml预温（37°C)的0. 075MKC1低渗液，用吸管打匀使细胞悬 浮于低渗液中，放回37°C温箱中低渗30分钟。该样可W使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞 解体。
[0031] (6)预固定：低渗30分钟后将培养物取出，加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸为 3 ;1) 1ml，吹打均匀。
[003引（7)再离屯、；1500转/分离屯、10分钟，吸去上层液，保留沉淀物。
[0033] (8)固定；沿离屯、管管壁加入固定液7ml，用吸管将底部沉淀物打匀，室温固定30 分钟。
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