034] (9)再离屯、；1500转/分离屯、10分钟，弃去上清液。
[003引（10)再固定离屯、：加入固定液7ml，打匀，1500转/分离屯、10分钟，弃去上清液。
[0036] (11)重复步骤10-次。
[0037](。）五次固定；加入固定液0. 5-lml，打匀制成细胞悬液。
[0038] (13)制片；用滴管吸细胞悬液，滴在已用4-6°C冰水浸泡的洁净载玻片上，促使细 胞平铺于载玻片上。然后立即放入80°C恒温干燥箱中烤片15分钟。
[0039] (14)染色；Giemsa染色。
[0040] 10、血液样品采集，种血72小时后，进行染色体制片，结果见表2,表2为各配方培 养基对外周血淋己细胞培养效果比较。
[00川表2
[0042]
[0043]备注；
[0044] 淋转率（转化淋己细胞百分数）=转化细胞百分数/总淋己细胞数量X100% ;
[0045] 分裂指数=分裂细胞数/(淋己细胞总数-分裂细胞数）X100% ;
[0046]CV(变异系数）表示淋己细胞培养效果的离散程度。
[0047] 实验结果，上述4种培养基细胞生长旺盛；其中培养基2培养效果相对其余=个培 养基效果差些，转化率低些，分裂指数较低。培养基3、培养基4、培养基1培养效果相当；培 养基5培养效果较其余=个效果好。该结果表明：甘油磯酸钢、肥阳S双缓冲系统要比甘油 磯酸钢、肥阳S单独使用效果更好，双缓冲系统对溶液的化值稳定性能更好，利于淋己细胞 生长。
[004引实施例2神变化测定
[0049] 将上述培养基1、培养基2、培养基3、培养基4放置37°C，常温放置，4°C放置，测试 抑值的变化。表3为各种各配方培养基抑稳定性能比较。
[0050] 表 3
[0051]
[0053] 从表中结果表明；非碳酸氨钢缓冲系统比碳酸氨钢缓冲系统抑值变化小，其中甘 油磯酸钢/肥阳S双缓冲系统抑值最稳定，在4°C条件下，可保存4月，抑值不变。
[0054] 实施例3 ;本发明的优选淋己细胞培养基的配制
[005引 1、材料；肥阳S、化2册04、皿2?04由上海生工工程生物提供；
[0056] 小牛血清，由杭州四季青提供；
[0057] 甘油磯酸钢，由Sigma公司提供；
[0058] 1640干粉、由GIBC0公司提供。
[0059] 2、设备神计，揽拌器。
[0060] 3、配制1L淋己细胞培养基方法：
[006U按照质量称取各组分；PMI-1640干粉10. 45g培养基，0. 1评HA，2肖化2册04， IgK&PCV3g甘油磯酸钢，3gHE阳S，加入500ml超纯水，200ml小牛血清；盐酸/氨氧化钢溶 液或者冲入二氧化碳调节抑至7. 2 ;最后用超纯水定容至1L，并用0. 22ym滤膜过滤除菌。
[0062] 实施例4 ;淋己细胞培养基与市场上淋己细胞培养基的培养效果比较
[0063] 选取在广州市场上传统含有牛血清的淋己细胞培养基最常见的两个品牌，自编号 为DH和YSJ。取血液样品，分别向上述两个品牌W及本发明的产品中滴入同一个人的血液 0. 5ml，细胞培养、染色体制片。结果见表4,表4为淋己细胞无血清培养基与市场上淋己细 胞培养基的培养效果比较结果。
[0064]表 4
[0065]
[0067]备注；
[006引淋转率（转化淋己细胞百分数）=转化细胞百分数/总淋己细胞数量X100% ;
[0069] 分裂指数=分裂细胞数/(淋己细胞总数-分裂细胞数）X100% ;
[0070]CV(变异系数）表示淋己细胞培养效果的离散程度。
[0071] 结果；市场上淋己细胞培养基效果相比，细胞生长和增殖效果相当，分裂指数差不 多。本发明的淋己细胞培养基，淋己细胞生长旺盛，增殖效果好；与市场上产品相比，本发明 的淋己细胞培养基效果较好。
【主权项】
1. 一种pH值稳定的淋巴细胞培养基，其特征在于，所述淋巴细胞培养基由1640基础培 养基、植物血球凝集素（PHA)、小牛血清和甘油磷酸钠/4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)双缓 冲系统组成；所述植物血球凝集素（PHA)的浓度为100mg/L，所述甘油磷酸钠/4-羟乙基哌 嗪乙磺酸（HEPES)双缓冲系统的浓度为5-50mM，所述小牛血清的体积百分比为20%。2. 根据权利要求1所述的淋巴细胞培养基，其特征在于，所述甘油磷酸钠/4-羟乙基 哌嗪乙磺酸（HEPES)双缓冲系统由磷酸缓冲液、甘油磷酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES) 组成，所述磷酸缓冲液含Na 2HPOdP KH 2P04。3. 根据权利要求2所述的淋巴细胞培养基，其特征在于，所述甘油磷酸钠的浓度为3g/ L，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)的浓度为3g/L，所述似 2即04的浓度为2g/L，所述 KH2PO4的浓度为lg/L。4. 一种制备权利要求1-3之一所述培养基的方法，其特征在于，按如下操作进行：取如 权利要求1-3之一所述培养基的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入去超纯水定 容，除菌。5. 权利要求1-3之一所述培养基在淋巴细胞培养中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种pH值稳定的培养基。该培养基由1640基础培养基、100mg/L植物血球凝集素(PHA)、体积百分比为20％的小牛血清和5-50mM甘油磷酸钠/4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)双缓冲系统组成。所述甘油磷酸钠/HEPES双缓冲系统由磷酸缓冲液、甘油磷酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)组成，所述磷酸缓冲液含Na2HPO4和KH2PO4。本发明还提供上述培养基的制备方法和在淋巴细胞培养中的应用。本发明的培养基的pH值不受环境中气体成分的影响，又能够稳定淋巴细胞培养时的pH值；利于培养基的长期保存。
【IPC分类】C12N5/0783, C12N5/0781
【公开号】CN104988120
【申请号】CN201510448310
【发明人】李晓辉, 胡可存, 刘强
【申请人】广州市达晖生物技术有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月27日