测量骨损失率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及诊断骨损失率的方法，尤其在骨锚定植入物领域。
【背景技术】
[0002] 每年进行很多大量牙植入物康复过程。与绝大多数种植治疗成功的病例相比，一 定数量的患者发生植入物周疾病（peri-implant disease，PI)。在一些情况中，利用机械 清创术的非手术治疗和用3%过氧化氢的冲洗可以是足够有效的治疗。在持续存在的植入 物周疾病的情况下，常常进行切除手术联合表面清创术。通过外科矫治在患病的植入位点 处的骨缺陷（例如骨峰），可以减少袋深度并提供有利于口腔卫生的软组织形态。然而，某 些患者对治疗的反应不足够好，并且尽管有良好的菌斑控制和最小的植入物周粘膜炎症， 在一些病例中，包括化脓和进行性骨损失的症状可能复发。这种复发的原因尚且未知。即 将有对植入物周疾病的病因学的改进的理解的需要和对允许早期检测和干预的更灵敏的 诊断工具的开发的需要；因此，增加易感患者中植入治疗的可预测性。此外，为了增加呈现 骨损失信号的植入物的存活率，需要在疾病进程的早期的临床干预。这需要可能的进行中 骨吸收的早期确定，并且因此，需要更灵敏的技术。
[0003] 骨吸收由单核吞噬细胞形成的骨吸收细胞，破骨细胞介导。替代损失的骨的新骨 由间充质间质细胞形成的骨形成细胞，成骨细胞沉积。参与重塑过程的各种其它细胞类型 由全身因子（例如，激素、淋巴因子、生长因子和维生素）以及局部因子（例如，细胞因子、 粘附分子、淋巴因子和生长因子）严格控制（W02012/061907)。
[0004] 植入物周疾病的诊断通常基于结合骨损失的放射照相证据的临床测量。植入物周 炎（Peri-implantitis)在临床上常常转化为袋（pocket)的形成和加深、植入物周上皮密 封的破坏、探查时出血（BoP)、化脓和进行性骨损失。这些诊断方法常常联合使用，用于诊断 作为植入物支撑组织中广泛的病理改变的指征的植入物周疾病。这种诊断方法有限的灵敏 度和/或特异性使得难以早期检测病理改变。
[0005] 已经由很多作者研究使用对菌斑样品中的龈沟液中的遗传标志物的分析作为可 能的用于植入物周疾病的预后和诊断工具的可行性，并有多变的结果，
[0006] 常常研究的标志物是白细胞介素-IP (IL-1P)，其是促炎细胞因子，参与多 种生物过程，包括免疫调节、炎症和结缔组织代谢。IL-1P刺激骨吸收并抑制骨形成 (Panagakos 等人，Int J Oral Maxillofac Implants 1996,11:794-799)。IL-10 主要 由巨噬细胞产生，但也由其它细胞包括嗜中性粒细胞产生。很多研究已经表明，IL-10 在植入物周围的沟液中的存在呈现植入物周疾病的信号。已经报道了，与健康位点 (Panagakos 等人，Int J Oral Maxillofac Implants 1996,11:794-799 ;Kao 等人，Int J Oral Maxillofac Implants 1995,10:696-701 ;Murata 等人，Clin Oral Impl Res 2002， 13:637-643)相比并且与植入物周粘膜炎位点（Murata等人，Clin Oral Impl Res 2002， 13:637-643)相比，并且此外当将对象与植入物周炎的早期和晚期信号相比时，植入物周炎 的显著升高的水平。然而，Hultin等人（Clin Oral Impl Res 2002,13:349-358)显示相 矛盾的结果，植入物周炎和健康位点之间无IL-1 0表达的差异。
[0007] 白细胞介素-8(IL-8)是嗜中性粒细胞的促炎症标志物和趋化因子。其参与调节 牙周炎（Nassar 等人，Infection and Immunity 2002,268_276 ;Goutoudi 等人，Int J Dent 2012 ;2012:362905)和植入物周炎（Petkovic 等人，Int J Oral Maxillofac Surg 2010， 39(5) : 478-85)中对微生物入侵的天然免疫应答。Nowzari等人（Clin Implant Dent Relat Res 2008,10(3): 166-173)研究了健康受试者中植入物和牙周围存在的细胞因子，并且发 现与牙相比，植入物周围IL-8的两倍增加。
[0008] 白细胞介素-6(IL-6)是由多种细胞产生的多功能细胞因子，调节血细胞生成、 炎症、免疫应答和骨稳态（Yoshitake 等人，J Biol Chem 2008,283:11535-11540)。在 Liskmann 等人的研究（Int J Oral Maxillofac Implants2006,21(4):543_50)中，与来自 健康受试者的唾液样品相比，来自患有植入物周疾病的受试者的唾液样品中的IL-6水平 显著升高。Konttinen 等人（Int J Periodontics restorative Dent 2006, 26:135-141) 测量了与健康植入物位点相比的在患有植入物周炎的失败的植入物处的统计学上更高水 平的IL-6。
[0009] 破骨细胞是源自单核细胞/巨噬细胞系的祖细胞的骨吸收细胞。破骨细胞生 成的过程由NF-kB配体的受体激活剂（RANKL)和骨保护素（0PG)协调，它们是肿瘤 坏死因子超家族的成员。在RANKL诱导破骨细胞生成的同时，其拮抗剂0PG抑制破骨 细胞的形成（Boyle 等人，Nature 2003,423:337-342 ;Leibbrandt 等人，Ann NY Acad Sci 2008,1143:123-150)。还已经发现0PG减少破骨细胞凋亡（Chamoux等人，J Cell Physiol.2008，216(2):536-42)。RANKL和0PG由成骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞分泌 (Corralini 等人，J Cell Physiol. 2011，226 (9): 2279-2286)。RANKL 也由激活的 T 细胞表 达（Saidenberg-Kermanac'h 等人，Eur Cytokine Netw. 2002,13(2): 144-53)。已经提不， 0PG和RANKL之间平衡的失调可能与涉及骨破坏的疾病如牙周炎相关。例如，Bostanci等 人（J Clin Periodontol 2007,34:370-376)表明，龈沟液中的RANKL和0PG水平在牙周炎 中是相对地调节的，但是在牙銀炎中不是这样；因此，与呈现不同程度牙周病（periodontal disease)的牙齿相比，在健康牙齿周围的龈沟液中记录到显著更低的RANKL/0PG比。尽管 如此，对植入物周围的沟液中的0PG和可溶RANKL的两项研究未能表明与临床参数的统计 学显著的相关性（Arikari等人，Clin Oral Impl Res 2008,19:283-288 ;Monov 等人，Clin Implant Dent Relat Res 2006,8(3): 135-141)。然而，在两项研究中，很多样品在测定的 检测极限外并且被从统计计算中排除或计作0。因此，作者得出结论，提供的数据应该考虑 这些限制来解释。还已经研究了 0PG对关节炎的发病机制的作用。例如，Liu等人（Chin Med J(Engl). 2010,123(11) : 1407-12)报道了，在患有早期类风湿性关节炎的受试者中，循 环的0PG的水平升高。已经表明，Wnt蛋白可以促进干细胞的维护和增殖（Willert等人， Nature2003,423 (6938) : 448-52)，并且Wnt信号通路对于成骨细胞生成发挥显著作用（供 回顾，参见 Yavropoulou 等人，Hormones，2007,6 (4) : 279-294)。
[0010] 组织蛋白酶K(CatK)是骨吸收标志物，其在活性破骨细胞中高度表达。已经 证明，与健康位点相比，在植入物周炎位点中有更高的CatK表达（Strbac等人，J Clin Periodontol 2006;33:302-308)。
[0011] 骨钙蛋白（0C)是参与骨矿化和钙稳态的骨的钙结合蛋白。Murata等人（Clin Oral Impl Res 2002,13:637-643)表明，与健康位点相比，来自粘膜炎位点的植入物周沟 液（PICF)中OC表达增加，同时在植入物周炎位点和粘膜炎或健康植入物位点之间未观察 到0C水平的差异。
[0012] 基质金属蛋白酶（MMP)是参与从损害的组织降解和去除胶原蛋白的蛋白水解酶。 MMP由存在于炎症位点的细胞分泌以响应刺激物如脂多糖和细胞因子（Aboyoussef等人， Int J Oral Maxillofac Implants 1998,13:689-696)。胶原酶和明胶酶是MMP超家族的两 个亚家族。丨〈ivel&-Rajam3ki.等人的发现（Clin Oral Impl Res 2003,14:158-165)表明， 增加的MMP-8 (胶原酶-2)的水平可能与炎性植入物周疾病的活性阶段相关。已经研究了 MMP_9(明胶酶B)的表达；同时Ma等人（Clin Oral Impl Res2003，14:709-713)表明MMP-9 和骨水平的关联，Aboyoussef 等人（Int J Oral Maxillofac Implants 1998,13:689-696) 未能表明健康和植入物周炎位点之间的任何显著差异。
[0013] MMP和基质金属蛋白酶的组织抑制剂（HMP)之间的失调被认为触发细胞外基 质、基膜和牙槽骨的劣化，并且因此引发牙周病（Sorsa等人，Oral Diseases 2004，10: 311-318)。已经提示，唾液MMP-8, HMP-1并且尤其是它们的比率是晚期牙周炎检测中的可 能候选物（Gursoy 等人，Clin Periodontol 2010, 37:487-493)。
[0014] 在生理学以及病理组织重塑中，纤溶酶原系统在细胞外蛋白水解中最重要（由 Collen，Thromb Haemost 1999,82:259-270综述）。纤溶酶是具有广泛活性的蛋白酶，其能 够分解很多胞外蛋白并且激活潜在的胶原酶和其它金属蛋白酶（Werb等人，New Eng J Med 1977, 296:1017-1023 ;Matrisian，Bioessays 1992,14:455-463)。纤溶酶通过切割非胶原 ECM蛋白直接作用于胞外基质（ECM)并还通过激活一系列其它酶（尤其是对不同结缔组织 蛋白具有特异性的基质金属蛋白酶（MMP))的前体形式间接作用。尽管纤溶酶原系统和其 它组织降解系统之间有相互作用，纤溶酶原代表重要的潜在蛋白水解潜能，并且严格控制 其激活对于维护组织的完整性是重要的。纤溶酶通过纤溶酶原激活物（丝氨酸蛋白酶，已 经鉴定了它的两种类型：尿激酶型，u-PA，和组织型，t-PA)自其无活性的前体纤溶酶原形 成，纤溶酶原激活物可以通过形成双分子1:1共价复合体被纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1 和PAI-2)特异抑制。已经显示，与健康位点相比，在来自发炎位点的龈沟液（GCF)中，tPA 和PAI-2的水平更高（Kinnby，Biol Chem 2002,383:85-92)。已经将PAI-2的相对增加的 水平与妊娠以及牙周炎中的组织-保护功能相关联（Kinnby等人，J Periodont Res 1996， 31: