mplantol 2011，4(4):371_382;Seibel， Clin Biochem Rev 2005， 26:97-122 ；ffatts, Clin Chem 1999,45(8)B:1359-1368 ；Christenson, Clin Biochem 1997,30 (8):573-593)。
[0069] 与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的标志物或其组合，或其比率不特别受限 并且可以是TRAP、和/或0PG、和/或CatK、和/或RANK、和/或RANKL、和/或骨钙蛋白、 和 / 或 IL-6、和 / 或 DKK-1、和 / 或 MMP-8、和 / 或 MMP-2、和 / 或 TIMP-1、和 / 或 tPA、和 / 或PAI-2、和/或来自组织蛋白酶家族的其它标志物、和/或骨涎蛋白（BSP)、和/或碱性磷 酸酶（ALP)和/或来自TGF-P超家族的标志物如骨形态发生蛋白（BMP)、和/或巨噬细胞 集落刺激因子（M-CSF)、和/或硬化蛋白（sclerostin) (Sost(骨硬化（Sclerosteosis)基 因）的蛋白产物）、和/或头蛋白（Noggin)或其组合中的一种或多种。优选的是那些标志 物或标志物的比率，其提供那些标志物的表达水平或标志物的比率和骨损失率之间的线性 关系，如TRAP、和/或0PG、和/或CatK和/或骨钙蛋白、和/或TRAP/0C、和/或Catk/0C。 备选地，优选的是那些标志物或标志物的比率，其提供那些标志物的表达水平或标志物的 比率和骨损失率之间二次方、和/或三次方关系、和/或四次方关系、和/或齐次多项式关 系、和/或指数关系、和/或对数关系。
[0070] 本发明的标志物可以通过以下登陆号来识别：
[0071] 白细胞介素-1 0 (IL-lb) :NM_000576. 2
[0072] 白细胞介素-6 (IL-6) :NM_000600. 3
[0073] 基质金属蛋白酶-8(MMP8) :NM_002424. 2
[0074] 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP) :NM_001611. 3
[0075] 组织蛋白酶 K :NM_000396
[0076] 骨保护素（0PG) :NM_002546
[0077] NF-kB 配体的受体激活物（RANKL) :NM_003701. 3
[0078] 白细胞介素-8 (IL8) :NM_000584. 3
[0079] 人 dickkopf 1 同系物（爪蟾（Xenopus laevis)) (DKK1) :NM_012242. 2
[0080] 基质金属蛋白酶的组织抑制剂OlMP-1) :NM_003254. 2
[0081] 组织纤溶酶原激活物（TPA) :NM_000930. 3
[0082] 2 型纤溶酶原激活物抑制剂（serpinB2) (PAI-2) :NM_001143818. 1
[0083] 骨钙蛋白（PMF1 或 0C) :NM_001199654. 1
[0084] 优选地，测量两种、三种、四种、五种、六种或更多种标志物的表达水平或其比率以 获得关于骨损失率的更准确的信息。
[0085] Dickkopf-相关蛋白-1 (DKK-1)是Wnt信号通路拮抗剂，并且其减少成骨细胞分 化。已经在患有类风湿性关节炎（Liu等人，Chin Med J (Engl). 2010,123(11) : 1407-12)和 银肩病关节炎（Dalbeth等人，Arthritis Res Ther. 2010,12(4) :R164)的受试者中测量到 升高的全身DKK-1水平。
[0086] 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)由破骨细胞皱褶缘分泌，将在脱磷酸化之前用作破 骨细胞的锚定物的骨桥蛋白脱磷酸化，并且允许破骨细胞迀移和进一步的骨吸收（Minkin， Calcif Tissue Int，1982,34:285-290)。
[0087] 用于量化活体外样品中与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的一种以上标志 物的表达水平或其比率的方法不特别受限并且可以选自量化核酸如mRNA的方法和/或量 化蛋白的方法如RT-qPCR(下文中称为qPCR)，和/或RNA印迹，和/或免疫测定，和/或 ELISA，和/或放射性免疫测定，和/或磁免疫测定，和/或荧光免疫测定，和/或免疫沉淀， 和/或表面等离子共振，和/或蛋白印迹，和/或免疫组化或其任意组合。优选的量化方法 是qPCR。实验过程通常包括样品处理步骤（即提取）。
[0088] 一种以上标志物的表达水平或其比率的量化可以通过一种以上参比基因 (reference gene)来归一化。归一化包括报告目的基因的表达水平与参比基因的表达水 平之比。参比基因可以使用可免费获得的N〇rmFind er17程序来选择。优选地，参比基因是 这样的基因，其被稳定表达并且其丰度显示与样品总量（在qPCR的情况下，与mRNA总量） 的强的相关性。更优选地，参比基因选自GAPDH、YWHAZ、UBC和/或HPRT-1，其中YWHAZ和 UBC是优选的。
[0089] 本发明的参比基因可以通过以下登陆号识别：
[0090] YWHAZ(参比基因）：NM_001135702. 1
[0091] UBC(参比基因）：NM_001135702. 1
[0092] 在本申请的语境中，标志物的表达水平可以是指（i)浓度、或（ii)对标志物特异 的检测信号、或（iii)通过数学变换与（i)和/或（ii)相关的值。
[0093] 在qPCR的情况下，优选通过以下方式计算相对基因表达水平将A A Cq方法 (Livak等人，Methods 2001,25:402-408)用于各个测定，并且通过参比基因来归一化各个 基因的基因表达。参比基因可以例如使用可以免费获得的NormFinder程序（www. mdl.dk/ publicationsnormfinder. htm. 2010年10月）来选择。然后，各受试者的归一化的基因表 达可以在对数变换后使用以下表达式来计算：归一化的基因g的表达=(Cq (n)-Cq (g))，其 中Cq(g)是基因g的扩增循环数，并且Cq(n)是取自受试者的样品的归一化因子（所选的 一个或多个参比基因的平均扩增循环数）。
[0094] 在qPCR的情况下，与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的一种以上标志物的表 达水平或其比率也可以通过量化相应的扩增子来量化。扩增子可以被定义为作为天然或人 工扩增或复制事件的来源和/或产物的一段DNA或RNA。在本发明的情况中，用于量化与破 骨细胞和/或成骨细胞或参比基因的活性相关的一种以上标志物的表达水平或其比率的 优选扩增子如下：
[0095] 白细胞介素-10 (IL-lb) :SEQ ID NO 1
[0096] 白细胞介素-6(IL-6) :SEQ ID NO 2
[0097] 基质金属蛋白酶-8(MMP8SEQ ID NO 3
[0098] 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP) :SEQ ID NO 4
[0099] 组织蛋白酶 K :SEQ ID NO 5
[0100] 骨保护素（0PG) :SEQ ID NO 6
[0101] NF-kB 配体的受体激活物（RANKL) :SEQ ID NO 7
[0102] 白细胞介素-8(IL8) :SEQ ID NO 8
[0103] 人 dickkopf 1 同系物（爪蟾）（DKK1) :SEQ ID NO 9
[0104] 基质金属蛋白酶的组织抑制剂OlMP-l) :SEQ ID NO 10
[0105] 组织纤溶酶原激活物（TPA) :SEQ ID NO 11
[0106] 2 型纤溶酶原激活物抑制剂（serpinB2) (PAI-2) :SEQ ID NO 12
[0107] 骨钙蛋白（PMF1 或 0C) :SEQ ID NO 13
[0108] YWHAZ(参比基因）：SEQ ID NO 14
[0109] UBC(参比基因）：SEQ ID NO 15
[0110] 在本发明的方法中，一个以上校准曲线可以在骨损失率和标志物的表达水平或标 志物的比率之间提供线性关系和/或三次方关系、和/或二次方关系、和/或四次方关系、 和/或齐次多项式关系、和/或指数关系、和/或对数关系。优选地，校准曲线可以在骨损 失率和标志物的表达水平/标志物的比率之间提供线性关系。校准曲线应该使用与用于要 插入其中的活体外样品的相同的一个或多个标志物和/或其比率以及相同的量化技术来 确定。
[0111] 本发明的方法可以用于指示存在或不存在影响骨的病症，优选影响植入物和/或 牙齿周围的骨的病症。更优选地，所述病症是植入物周疾病，和/或牙周病、和/或关节 炎（arthritis)、和/或类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis)、和/或银肩病关节炎 (psoriatic arthritis)、和/或骨质疏松症（osteoporosis)和/或其组合，其中优选的是 植入物周疾病（peri-implant disease) 〇
[0112] 植入物周疾病（在存在骨退化的情况下也称为植入物周炎）被定义为在功能 上影响植入物周围的组织的炎症过程，其导致支撑骨的损失（Becker等人，Int J Oral Maxillofac Implants 1990,5:31-38)。粘膜炎常涉及软组织炎症、肿胀、探查时出血，并且 在一些情况下涉及化脓，但无骨损失迹象。
[0113] 本发明的方法也可以用于评价植入物的预后。
[0114] 本发明人研究了与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的某些标志物的表达水 平或两种以上标志物之间的比率或其组合与骨损失率之间的相关性，使得作为影响骨的病 症的诊断因素的用途成为可能。因此，通过本发明的方法，个体患者可以被诊断为患有或未 患有影响骨的病症，优选影响植入物和/或牙齿周围的骨的病症。
[0115] 本发明人已经证明，从经历植入物治疗的患者获得的植入物周沟液中与破骨细胞 和/或成骨细胞的活性相关的某些标志物的表达水平或两种以上标志物之间的比率与骨 损失率相关。该方法提供骨损失率的快速确定，其对于诊断植入物周疾病和选择合适的治 疗是必要的。
[0116] 用本发明的方法，可能检测由差的假体结构产生的过载所导致的骨损失率，由于 在窄的牙槽嵴中放置过大的植入物导致的骨损失率，以及植入物放置导致过薄的骨断面的 其它情况。因此，临床医生将提供合适的治疗。因此没有必要将受试者暴露于辐射，并且临 床医生不必需等待直到骨退化进展到通过放射照片评价的可测量的水平以选择治疗并确 定患者的预后。
[0117] 测量其骨损失率的活体外样品可以获自可能患有或可能未患有影响骨的病症 (优选影响植入物和/或牙齿周围的骨的病症）的患者。优选的患者是具有一种以上植入 物，更优选骨锚定植入物的患者。所述植入物可以是牙植入物、和/或髋植入物、和/或膝 盖植入物。
[0118] 优选地，患者患有和/或可能患有影响植入物支撑组织的病症，和/或影响支持植 入物的骨的病症，和/或影响牙齿周围组织的病症，如植入物周炎，和/或粘膜炎，和/或牙 周炎，和/或牙龈炎或其组合。更优选地，所述患者患有和/或可能患有植入物