周疾病。备 选地，患者患有和/或可能患有影响骨的病症，如关节炎、类风湿性关节炎、银肩病关节炎、 骨质疏松症等。
[0119]患者的活体外样品中TRAP、TRAP/0C、CatK/0C和0PG中的1、2、3、4、或5或6个的 表达水平可以通过qPCR量化。骨损失率的确定可以通过将在量化步骤中获得的一个或多 个值插入校准曲线中来进行。优选地，该信息指示适当的治疗和/或疾病预后。
[0120] 0. 2mm/年或低于0. 2mm/年的骨损失率可以指示包括标准的护理口腔卫生处理和 维护程序的治疗。
[0121] 在1至1. 5mm/年的范围内的骨损失率可以指示包括标准的护理口腔卫生处理和 维护程序和在数月内的随访的治疗。
[0122] 2. 0_/年或高于2. 0_/年的骨损失率可以指示需要外科治疗。
[0123] 在植入后第一年期间不超过1. 5mm/年的骨损失率或之后少于0. 2mm/年的骨损失 率可以指示口腔卫生的标准程序。
[0124] 植入物插入的第一年后0. 2至2. 0mm/年的骨损失率可能表示口腔卫生的标准程 序和数月内的随访。如果骨损失率保持在1. 5至2. 0_/年，则临床医生可以进行对该位点 的外科治疗。
[0125] 植入物插入后第一年期间超过1. 5_/年的骨损失率可能表示错误的植入物位置 或不胜任的植入物载量并且可以指示外科治疗。植入物插入的第一年后超过2. 0_/年的 尚骨损失率可能指不外科治疗。
[0126] 术语"人受试者"、"受试者"和"患者"在本申请中可交替地使用。术语"病症"和 "疾病"在本申请中可交替地使用。
[0127] 此外，本发明提供用于进行本发明的方法的试剂盒。指示某种治疗的骨损失率值 可以用所述试剂盒提供。在试剂盒的帮助下，可以计算患者的骨损失率。本发明的试剂盒可 以包括样品收集装置，其不受限制并且是用于采集样品如体液或组织的装置。优选地，所述 样品收集装置用于采集植入物周沟液样品。所述样品收集装置可以是吸收体（absorbent) 如无菌纸尖和/或注射器和/或活检装置。优选地，所述样品收集装置是无菌吸收体，更优 选地是无菌纸尖。
[0128] 本发明的试剂盒还可以包括用于保存样品的保存介质。保存介质的目的是保存生 物样品，并且可以是被配制成保持用于下游分析的样品的整体性和活力的任何介质。优选 地，保存介质可以包含RNA酶抑制剂。更优选地，保存介质是RNALater保存介质（Qiagen， Hi 1 den，Germany) 〇
[0129] 本发明的试剂盒还可以包含关于怎样进行本发明方法的使用说明。
[0130] 本发明的试剂盒还可以含有盒子用于将样品送至中央实验室，在那里量化与破骨 细胞和/或成骨细胞的活性相关的一种以上标志物或其组合的表达水平。将表达水平值插 入一个以上校准曲线可以在中央实验室中进行。备选地，所述试剂盒可以包括一个以上校 准曲线，表达水平值可以被插入其中并且与骨损失率关联。
[0131] 备选地，本发明的试剂盒可以含有必要元件以量化与破骨细胞和/或成骨细胞的 活性相关的一种以上标志物或其组合的表达水平。在该情况下，所述试剂盒可以包含至少 一种可检测标签和至少一种底物，所述底物特异识别与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相 关的一种以上标志物或其组合。
[0132] 如果量化通过mRNA量化的方式进行，则所述试剂盒还可以包括一个或多个引物 序列用以检测并量化与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的标志物。
[0133] 如果量化通过蛋白量化的方式进行，则所述试剂盒还可以包括一种或多种底物用 以检测并量化与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的标志物。优选的底物是抗体，单克 隆抗体、多克隆抗体或其片段。所述试剂盒还可以包括一抗和二抗，以及标记的抗体。
[0134]在这些情况中，所述试剂盒还可以包括一个或多个校准曲线用以插入表达水平值 并确定骨损失率。
[0135] 可以使用所述试剂盒并且该用途不特别受限，但是用于本发明的方法的任何实施 方案中是优选的。
[0136] 当在本文中使用时，"一以上（one or more) "还包括一和大于一的任何数目（如 二、三、四、五、六等）的个体指定。当在本文中使用时，"超过一"或"数个"包括大于一的任 何数目（如 二、三、四、五、六等）的个体指定。
[0137] 除非明确另有说明，在本文的语境中术语"包含"用于表明除了由"包含"引入的 列表的成员之外，可以任选地存在另外的成员。然而，作为本发明的一个具体实施方案，预 期的是，术语"包含"包括不存在另外成员的可能性，即对于该实施方案，"包含"要被理解为 具有"由…组成"的含义。 实施例
[0138] 实施例1 :柃准曲线
[0139] 受试者
[0140] 这是非随机、单盲（样品分析者）的对照临床探索性研究，其由地方伦理委员会， University ofGmeborg，Sweden批准（Dnr :652-10)。该研究包括25位具有健康植入物 位点的受试者，25位具有植入物周粘膜炎位点的受试者和25位具有明显植入物周炎的临 床体征的受试者。该研究限于单个评价时间点。研究参与者选自之前用牙植入物修复的， 在.Branemark Clinic，Gdteborg，Sweden参加定期的植入物维护期的受试者。在任何研 究相关的过程进行之前，各个受试者参与知情同意程序并且签署知情同意书（ICF)并注明 日期。评价每个受试者的一个植入物位点，并且基于下文所述的标准将选择的位点归类为 健康（HI)、粘膜炎（MC)或植入物周炎（PI)位点。每个位点使用三个汇集的（pooled)纸尖 从植入物位点收集植入物周沟液（PICF)。样品分析和统计中涉及的所有人不知道受试者身 份，并且样品分析中涉及的人也不知道样品类型（HI、MC或PI)。遗传标志物表达的分析由 独立的测试实验室（Tataa Biocenter，G親eb〇rg，:Sweden)进行。
[0141] 纳入/排除标准
[0142] 为了参与本研究，各个受试者满足表1中提供的一般标准1-5中的每一个。为了 被包括在HI、MC或PI组中，受试者必须分别满足表2、3和4中提供的纳入标准。所有三个 组的排除标准在表5中提供。受试者健康状况和治疗如抗炎治疗、骨质疏松症、糖尿病、不 受控的甲状旁腺功能充进（hyperparathyroidism)、皮质类留醇和骨合成代谢治疗、恶性肿 瘤史、使用烟草和/或其他含尼古丁的产品不是排除标准，但这些状况、治疗和使用被记录 在病例报告表（Case R印ort Forms) (CRF)中。允许在受试者登记前30天内接受的所有常 规处方药和/或其它常规治疗（除了抗生素治疗）并记录在CRF中。研究招募前3个月内 的抗生素治疗被禁止。
[0143] 对于所有受试者，受试者年龄、性别、口腔健康、Mombelli修正的出血指数（mBI)、 修正的菌斑指数（mPI)、植入物周的袋深度（PIPD)、附着粘膜的高度和化脓的存在也在CRF 中记录和量化。
[0144] 如果受试者满足符合条件的标准，两组中受试者招募以连续方式进行。纳入期为 约一年，在整个期间招募全部三个组中的受试者。
[0145] 随机化不适用。进行临床检查和PICF取样的临床研究者不知晓研究参数。参与 样品分析的所有其它人不知道受试者身份。参与进行PICF样品的qPCR分析的人不知道样 品的类型（HI、MC或PI)。参与进行统计分析的人不知道研究群体。
[0146] 样品的收集
[0147] PICF取样如下进行：将三个无菌纸尖（Roeke，Coltene，Germany)插入植入物周 沟/袋的基部并在选择的植入物位点处原位停留至少60秒。将三个纸尖立即转移至一个 (1)含有 RNALater 保存介质（Qiagen，Hilden，Germany)的 2ml 塑料管（Microtube，2ml， Sarstedt，Numbrecht，Germany)中；即，将三个样品汇集。当操作管时总是使用洁净的手 套。将纸尖完全浸没在保存介质中。将汇集的样品在环境温度在取样日从Brlnemark Clinic转移至用于分析基因标志物的当地实验室。
[0148] 样品的操作和分析
[0149] qPCR 样品的分析通过 TATAA Biocenter AB(Gdteb〇rg，Sweden)根据标准步骤来 进行，这之前已经在Hall等人（Eur J Oral Implant 2011，4(4):371_382)中描述。简言 之，将来自附着于纸尖的细胞的RNA在TATAA Biocenter提取。然后使用Qiagen RNeasy Micro试剂盒（Qiagen AB，Solna，Sweden)根据制造商的使用说明纯化细胞。使用包含在 试剂盒中的载体RNA来最小化提取过程中的RNA损失。使用BioRad iScript cDNA合成 试剂盒（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA)根据制造商的使用说 明，使用 5 y 1 RNA，将 RNA 转变为 cDNA。将 cDNA 在超纯水（Invitrogen Corp.，Carlsbad， California，USA)中稀释到50 yl。然后进行样品的定量聚合酶链反应（qPCR)测定。分 析的生化标志物列在表6中。在定量PCR中使用Perfecta SYBR Green Supermix(Quanta BioSciences，Gaithersburg，Maryland，USA)和 2 yl cDNA 模板与 0.4 yM 的正向和反向 引物。一式两份地量化各个cDNA样品。使用以下温度方案：在98°C酶激活3分钟，接着在 95°C 20秒，在60°C 20秒和在72°C 20秒的45个循环。在最后一次温度循环期间，在FAM/ SYBR通道进行焚光检测。在LightCycler 480系统（Roche，Penzberg，Germany)上进行实 验。扩增后，产生解离/解链曲线以证明产生特异产物。通过以下方法计算相对基因表达 水平：使用□□ Cq方法（Livak等人，Methods 2001，25:402-408)，对于各个测定使用90% 效率，并且通过使用可免费获得的NormFinderl7程序选择的两个参比基因（UBC和YWHAZ) 将各个基因的基因表达归一化。在所述程序中运行四个基因GAPDH，YWHAZ ;UBC，HPRT-1后， 选择所述两个基因。四个归一化基因的选择是基于我们之前的可行性研究的结果（Hall等 人，Eur J oral Implantol 2011，4(4):371-382)，其中研究了 9个参比基因，并且也使用了 利用纸尖的PICF取样。主要标准是，参比基因表达的变化应该在HI、MC和PI组内和之间 最小。
[0150] 基于由分光光度计量化的纯化的PCR产物确定所有基因的Cq的量化极限（L0Q)。 对于所有测定，生成每点重复四次的五点标准曲线，并且在十倍稀释系列中以10至1〇 6拷 贝/yi的浓度运行。上述所有数据，确定的L0Q-值从分析中省略。该过程使得数据分散 减小并且使得数据分布变窄，这增加了观察到三个受试者组之间基因表达的显著差异的可 能性。
[0151] 为了研究qPCR分析是否被样品基质（例如化脓的存在）抑制，给来自PI组的14 个样品添加（spike)已知浓度的RNA-spike(