271-277 ;01ofsson 等人，J Periodont Res 2002, 37:6〇-65)〇
[0015] 已经提议了不同的针对植入物周疾病的治疗替代方案。已经提示，在植入物周粘 膜炎的情况下，非手术治疗（例如表面清创术而不利用手术）可以是成功的，但对于呈现 植入物周炎的位点似乎不那么有效（Renvert等人，J Clin Periodontol 2008, 35 (Suppl 8) :305-315)。临床数据提示外科治疗一例如开放清创术（包括表面消毒结合全身抗生 素）一对于植入物周炎病变可能是可行的治疗选项（Claffey等人，J Clin Periodontol 2008, 35 (Suppl 8) :316-332)。然而，至今不存在通用的疗法，并且晚期植入物周炎仍难以 治疗。植入物顶部区域周围的边缘骨（marginal bone)通常是植入物健康的重要指示物。 边缘骨的水平可以在最初植入物手术时从植入物的顶部位置测量。评价骨损失的最常见 方法是通过放射摄影评价。因此，可以在放射照片上测量骨水平并且可以将其定义为从固 定器和其桥基之间的接合处至相对于植入物中间和远端的边缘骨的顶部的距离（Ahlqvist 等人，Int J Oral Maxillofac Implants 1990,5 (2): 155-163)。当然，常规放射摄影仅 监测植入物体部周围骨损失的中间或远端方面（Misch等人，Implant Dentistry 2008， 17(1) :5-15)。缺乏关于进行中的骨损失的清楚的信息可能导致不必要的或甚至错误的对 植入物周疾病的治疗。植入物周骨水平确定自通常在诊断时拍摄的放射照片。将骨水平与 被认为正常的相比较，并且将在更早的时间点拍摄的一张以上放射照片用于评价骨损失。 然而，放射照片提供骨状况的静止图像；因此，骨脱矿质的证据不必然意味着进行的疾病活 动。这对于牙周骨水平也适用，并且关于牙周炎进程的数据不证明连续过程，而是显示活动 的爆发（恶化）、缓解和不活动期（Hall 等人，Eur J oral Implantol2011，4(4):371-382)〇 此外，放射照片的有限的灵敏度很少允许在涉及多种疾病的病理性骨退化过程的非常早期 阶段的检测。此外，重要的是，使用合适的和可重复的投影技术进行所有放射摄影检查。在 放射照片上进行的测量的精确度低，尤其是当涉及小的平均骨损失时，并且其表明在解释 它们时所涉及的难度。此外，骨损失率仅能在长的时间段内测量，通常是一年（Ahlqvist等 人，Int J Oral Maxillofac Implants 1990, 5 (2): 155-163)，并且包括将患者暴露于频繁 的辐射。因此，看起来可能的是，植入物周炎和牙周炎患者中的进行的骨退化的确定是增加 的个性化患者治疗的精确度的前提条件。
[0016] 植入物成功允许不超过第一年1. 5mm的植入物载量和之后0. 2mm/年的植入物载 量的骨损失率。进展更快的骨损失指示植入物周炎、植入物过载或妨碍植入物位点处的愈 合能力的欠佳的植入物放置。植入物周炎和牙周炎以两阶段的方式进展，其中具有骨损失 的活跃期之后是不具有骨损失或具有不明显的骨损失的消极期等（Hall等人，Eur J oral Implantol 2011，4(4) : 371-382)。因此，如果骨损失率应该保持在某水平不变，则在植入物 或牙齿不再由锚定骨支撑前将花费一定时间，这取决于植入物或牙齿的长度以及保留的周 围骨的承载能力。
[0017] 发明概述
[0018] 因为缺少关于进行中的骨损失的明确信息可能导致不必要的或甚至错误的对影 响骨的病症的治疗，非常需要快速且准确地确定骨损失率以增加个性化患者治疗和疾病预 后的准确度。在本发明的语境中，骨损失率可以被定义为进行中的骨退化的测量。换句话 说，骨损失率可以使用本发明定义为骨水平随时间的改变。更优选地，本发明设法将表达 水平与口腔中边缘骨水平的变化联系起来，其深入地有助于在计划和提供相关治疗方面指 导临床医生。放射照片有限的灵敏度很少允许检测这些疾病中涉及的病理性骨退化过程 的非常早期阶段。获得的放射照片在检查时提供关于边缘骨水平的信息，但是它们不提供 对进行中的骨退化的明确确定。此外，使用常规放射照片的边缘骨水平改变的测量的量化 极限之前已被估计为 〇.47mm(Ahlqvist 等人，Int J Oral Maxillofac Implants 1990， 5(2) :155-163)。因此，看起来可能的是，快速确立患有影响骨的病症的患者中的进行中的 骨退化是增加患者诊断和治疗的精确性的先决条件。这还避免了将患者暴露于频繁的辐 射。
[0019] 本发明因此提供一种测量骨损失率的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0020] a)量化与活体外样品中的破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的一种以上标志 物的表达水平或其比率；和
[0021] b)通过在一个以上校准曲线中插入步骤a)中获得的值来确定作为边缘骨水平的 进行中的损失的函数的骨损失率。
[0022] 此外，本发明提供用于进行本发明方法的试剂盒。本发明提供方法和试剂盒，所述 方法和试剂盒使临床医生能够更快速和准确地提供可能确立进行中的退化的明确的数据。 其意味着更少暴露于放射摄影装置并且设法将测试结果与骨水平的变化关联。
[0023] 术语和缩写
[0024] CatK 组织蛋白酶K
[0025] cDNA 互补 DNA
[0026] Cq量化循环
[0027] DKK-1 Dickkopf-相关蛋白 _1
[0028] DNA 脱氧核糖核酸
[0029] ECM 细胞外基质
[0030] ELISA酶联免疫吸附测定
[0031] GAPDH 3-磷酸甘油醛脱氢酶
[0032] GCF 銀沟液（Gingival crevicular fluid)
[0033] HPRT1次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
[0034] IL 白细胞介素
[0035] MC粘膜炎
[0036] MMP 基质金属蛋白酶
[0037] mRNA 信使 RNA
[0038] 0C 骨f丐蛋白（Osteocalcin)
[0039] 0PG 骨保护素（Osteoprotegerin)
[0040] PAI-2 2型纤溶酶原激活物抑制剂（SerpinB2)
[0041] PI 植入物周炎（Peri-implantitis)
[0042] PICF 植入物周沟液（Peri-implant crevicular fluid)
[0043] qPCR定量聚合酶链式反应
[0044] RANKL NF-kB配体的受体激活剂
[0045] RNA 核糖核酸
[0046] SEQ 序列
[0047] TIMP 基质金属蛋白酶的组织抑制剂
[0048] tPA 组织纤溶酶原激活物
[0049] TRAP 抗酒石酸酸性磷酸酶
[0050] UBC 泛素 C
[0051] uPA 尿激酶纤溶酶原激活物
[0052] YWHAZ酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，G多肽
[0053] 附图简述
[0054] 图1 :TRAP和骨损失率之间的相关性。骨退化率在X-轴（mm/年）中表示。Y-轴 表示TRAP的水平（归一化的表达）。
[0055] 图2 :TRAP/0C和骨损失率之间的相关性。骨退化率在X-轴（mm/年）中表示。 Y-轴表示TRAP/0C的水平（归一化的表达）。
[0056] 图3 :CatK/0C和骨损失率之间的相关性。骨退化率在X-轴（mm/年）中表示。 Y-轴表示CatK/OC的水平（归一化的表达）。
[0057] 图4 :0PG和骨损失率之间的相关性。骨退化率在X-轴（mm/年）中表示。Y-轴 表示0PG的水平（归一化的表达）。
[0058] 发明详述
[0059] 详述公开了本发明的各个特征的具体和/或优选的变化形式。本发明还预期通过 组合针对本发明的两个以上的特征所述的两个以上的具体和/或优选的变化形式所产生 的那些实施方案作为特别优选的实施方案。
[0060]本发明提供一种测量骨损失率的方法。所述方法包括以下步骤：（i)量化活体外 样品中与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的一种以上标志物的表达水平或其比率；和 (ii)通过将步骤（i)中获得的值插入一个以上校准曲线中来确定骨损失率。本发明人已经 证明，与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的一种以上标志物的水平或它们中的两个或 更多个之间的比率与骨损失率相关。这允许快速和灵敏地确定骨损失率，这在本发明之前 是不可能进行的。骨损失率可以指不存在或不存在影响骨的病症。此外，骨损失率可以指 示患者应该进行特定治疗。
[0061] 本文中使用术语"插入一个以上校准曲线中"是指在已知或已确定的值之间估计 一个值。
[0062]在连续观察的语境中，仅可以判断植入物是与骨整合的（osseointegrated)， 因为破坏界面变化可能是逐渐的并且至少在短期内在放射摄影分辨率水平是不明显的 (Albrektsson等人，J0MI 1986,1 (1) : 11-25)。本发明提供快速检测骨损失率的方法，所述 方法防止患者承受不必要的辐射暴露并且提供给临床医生有价值的信息以诊断，选择合适 的疗法和/或评价植入物的预后。
[0063]在本发明的语境中，骨损失率可以定义为进行中的骨退化的测量。换句话说，骨损 失率可以被定义为骨水平随时间的改变。适当地选择时间间隔以在干预后的具体阶段，如 愈合阶段、加载阶段、手术后阶段，检测手术的效果和/或与疾病结合的干预的效果。例如， 随访作为吸烟者或患有糖尿病或以其它方式具有暴露于骨损失的风险的类别中的患者可 能是有趣的。在骨整合牙植入物的特别例子中，骨水平可以被定义为从固定器和其桥基之 间的接合处至相对于植入物中间和远端的边缘骨的顶部的距离。
[0064] 活体外（ex vivo)样品优选为体液或组织。体液可以是口腔液、和/或血清、和/ 或血浆、和/或脑脊液、和/或滑液、和/或腹膜液、和/或血液、和/或唾液，优选龈沟液并 且更优选植入物周沟液。
[0065] 组织可以是骨、和/或临近骨的组织、和/或结缔组织、和/或骨髓、和/或软骨、 和/或齿龈、和/或粘膜、和/或植入物支撑组织、和/或临近植入物的骨、和/或临近牙齿 的骨。
[0066] 测量其骨损失率的活体外样品可以从受试者的体液或组织获得。优选地，活体外 样品通过将一种以上无菌吸收体如无菌纸尖插入植入物周沟/袋基部，留在原位至少60秒 来获得。优选，将三个以上无菌纸尖插入沟/袋中。
[0067] 生物标志物（下文为标志物）可以被定义为被客观测量并且评价为正常生物学 过程、发病过程和对治疗干预的药理反应的指示物的物质。生物标志物是可以用于监测 健康状况、疾病发作、治疗反应和结果的分子（Zia等人，Biology and medicine 2011， 3(2) : 45-52)。
[0068] 与破骨细胞和/或成骨细胞的活性相关的标志物是与骨代谢（骨周转和/或 骨形成和/或骨吸收和/或骨重塑）相关的标志物并且是本领域中公知的（即Hall 等人，Eur J Oral I