[0078] 分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物Dehydrin_0FR-S C -AAGGAT CCATGGAGCACCAGGGACAGTA-3r ),Dehydrin_0RF-A(5r -AACTAGTGTGCTGGCCGGGGAGCTT-3') 并在基因全长序列两侧分别引入Bam HI与Spe I酶切位点，以狗牙根'Tifway' cDNA为模 板进行PCR。回收PCR产物并连接到pMD18-T Simple vector载体上，挑取单克隆菌斑进行 PCR 验证。狗牙根 'Tifway' Dehydrin 基因家族存在 2 个成员（Dehydrin-L, Dehydrin-S)， 500bp左右的较长片段为Dehydrin-S (图4,泳道5-7)，提取阳性克隆菌液质粒。将目的片段 质粒与PHB双元转化载体进行BamHI与Spe I双酶切，回收酶切后的PHB载体与Dehydrin-S 片段，应用T4连接酶在16°C水浴中将Dehydrin-S与PHB载体连接过夜构建转化载体，并将 载体转化农杆菌GV3101。
[0079] (2) Dehydrin-S 转化拟南芥
[0080] 1.预摇农杆菌：挑阳性单克隆至25ml含50mg/L Kan、50mg/L庆大霉素、25mg/L Rif的YEP液体培养基中，28°C，200rpm摇菌24h ;
[0081] 2.扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至含400mL Kan抗性YEP培养 基中，28°C，200rpm，培养13-16h，培养至吸光度OD6。。达到1. 5-2. 0之间收菌，收菌条件是 23 °C,5000rpm,8min ；
[0082] 3.转化植株：（需要在转化前一天或是转化当天剪去植株上所有的角果和盛开以 及露白的小花）配制500mL含5%蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将收集的农杆菌沉淀 悬起，摇匀，向剩余的蔗糖溶液中加入0.04% (v/v)的Silwet L-77与IOyL 6-BA(母液为 lmg/mL)，搅匀，在转化前将二者混匀，将植株茎部及花序浸泡在菌液中50s，取出沥干菌液， 放入一次性塑料袋中，密封保湿。将所有植株转化完毕后，罩上黑盒子，避光培养24h。之后 取出植株，将植株直立放置，浇水培养，保证植株水分充足。
[0083] (3)转基因阳性株系的筛选
[0084] 转化后的植株待角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一 周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因 TO代种子并 播种于穴盘中，用〇. 05% (v/v)草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得Tl代转基因植株，持续筛选 直至获得T3代纯合体转基因植株。
[0085] 实施例5、拟南茶Dehydrin-S转基因植株干旱胁迫生理学研究
[0086] (1)拟南芥Dehydrin-S转基因植株失水率检测
[0087] 剪切拟南芥野生型与Dehydrin-S转基因植株叶片0.5g，放置于铝盒内，在不同阶 段（0-12h)称取叶片重量，计算不同植物失水率。随时间推移，Dehydrin-S转基因植株失 水率明显低于对照植株约5-18% (图5)，说明Dehydrin-S基因在离体干旱条件下对植物 具有更好的水分保持作用。
[0088] (2)拟南芥Dehydrin-S转基因植株干旱胁迫表型观察
[0089] 将拟南芥野生型与Dehydrin-S转基因植株种植于气温22 °C、光强6000勒克斯、光 周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱中，同时进行干旱胁迫处理进行表型对比观察。 干旱胁迫4天时，野生型与Dehydrin-S转基因拟南芥植株表型具有显著性差异；野生型植 物叶片干枯萎蔫，花葶出现倒伏；Dehydrin-S转基因植株叶片萎蔫程度较小，花葶直立，植 株生长情况优于野生型拟南芥（图6)。说明Dehydrin-S转基因植物在干旱条件下具有更 好的抗旱性。
[0090] (3)拟南芥Dehydrin-S转基因植株电导率检测
[0091] 剪切拟南芥野生型与Dehydrin-S转基因植株干旱胁迫4天的叶片0. 2g，收集于 50ml离心管中，加入20ml去离子水，放置于摇床上24h，测定电导率初始值；放入高压灭菌 锅中（121°C)处理15分钟，测定电导率最终值。用初值比终值计算得出样品相对电导率 值。干旱胁迫4天后的野生型植物相对电导率值为87. 7% ,Dehydrin-S转基因植株的相对 电导率值为70. 0%，明显低于野生型植株（图7)。说明Dehydrin-S转基因植物在干旱胁 迫条件下细胞受害程度低于野生型植株。
[0092] (3)干旱胁迫条件下野生型与转基因拟南芥植株Dehydrin-S基因表达差异
[0093] 剪切拟南芥野生型与Dehydrin-S转基因植株干旱胁迫4天的叶片0. 2g，按实施 例3中方法提取RNA、制备cDNA并进行实时定量PCR分析。Real-time PCR中Dehydrin-S 基因定量分析的特异性引物为qDHN F C -CGGAGGAAGAAGGGAATC-3 ')，引物qDHN R(5' -TCTCCTTGATCTTGTCCAT-3')，内参基因为拟南 actin2 基因，引物为 act-F(5' -CTT 作相对定量分析，结果表明干旱胁迫4天后的转基因拟南芥中Dehydrin-S的表达量较高， 是内参基因 actin2的11. 72倍，是野生型植物的1711倍（图8)。表明Dehydrin-S没有在 野生型植株中表达。
[0094] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种如下（a)或（b)的蛋白质： (a) 由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有 脱水素酶活性的由（a)衍生的蛋白质。2. 如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO. 4所示氨基酸序 列经过1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20 个以内氨基酸而得到的序列。3. 如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列 中1~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。4. 一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。5. 如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为： (a)碱基序列如SEQ ID NO. 3第1~495位所示； 或（b)与SEQ ID NO. 3第1~495位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或（c)能与SEQ ID NO. 3第1~495位所示的核酸进行杂交的序列。6. 如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQ ID NO. 3第1~ 495位所示的核酸序列中1~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5'和/或3' 端添加60个以内核苷酸形成的序列。7. -种用于检测如权利要求4所述核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为包含有 所述核酸序列8~100个连续核苷酸的核酸分子。
【专利摘要】本发明涉及一种狗牙根‘Tifway’脱水素蛋白Dehydrin-S及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由如SEQ？ID？NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ？ID？NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有狗牙根‘Tifway’脱水素蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为利用基因工程技术调控狗牙根‘Tifway’抗旱等逆境胁迫生理响应，从而达到提高草坪草抗旱能力的目的，为分子育种提供了理论依据，具有很大的应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68, C07K14/415, C12N15/29, C12N15/11
【公开号】CN105017394
【申请号】CN201510179091
【发明人】周鹏, 安渊, 吕爱敏, 张荻, 李姣姣
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年4月15日