NAi元件的表达不会影响其他GRAS蛋白的表达和功能。
[0039] 首先，用陆地棉基因组DNA为模板分别扩增GAI1~4的DELLA和VHYNP结构域编 码序列，引物分别为GAIli-F/R、GAI2i-F/R、GAI3i-F/R和GAI4i-F/R(表2)，方法同上述常 规试验操作的DNA片段扩增。进一步用上述DNA片段回收方法回收扩增的GAIl~4片段。 [0040] 表2 GAIsRNAi元件扩增引物序列
[0042] 第二，利用不对称重叠 PCR方法将回收的4个GAI片段串联。先将GAIl和GAI2、 GAI3和GAI4分别串联。构建4个扩增体系如下：
[0043] (1)回收的 GAIl 片段约 5ng，2yL 弓丨物 GAIli-F(5ymol/L)，l yL 弓丨物 GAIli-Rd μ mol/L);
[0044] (2)回收的 GAI2 片段约 5ng，l yL 弓丨物 GAI2i-F(l ymol/L)，2yL 弓丨物 GAI2i-R(5 ymol/L)；
[0045] (3)回收的 GAI3 片段约 5ng，2yL 弓丨物 GAI3i-F(5ymol/L)，l yL 弓丨物 GAI3i-R(l ymol/L)；
[0046] (4)回收的 GAI4 片段约 5ng，l yL 引物 GAI4i-F(l ymol/L)，2yL 引物 GAI4i-R(5 μ mol/L) 〇
[0047] 扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94°C，5min ;94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，30个循环；72°C延伸3min。分别将体系1和体系2混合、体系3和 体系4混合，56°(：，111^11，72°(：，31^11。扩增产物经琼脂糖电泳后，目的条带6411+6412和 GAI3+GAI4分别回收。
[0048] 进一步用GAI1+GAI2和GAI3+GAI4为模板完成4个GAI片段的串联。构建2个扩 增体系如下：
[0049] (5)回收的 GAI1+GAI2 片段约 5ng，2 yL 引物 GAIli-F(5 μ mol/L)，I yL 引物 GAI3i-R(l ymol/L)；
[0050] (6)回收的 GAI3+GAI4 片段约 5ng，1 μ L 引物 GAI3i-F (1 μ mol/L)，2 μ L 引物 GAI4i-R(5 μ mol/L) 〇
[0051] 扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为：94°C，5min ;94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，30 个循环；72°C延伸 3min。将体系 5 和体系 6 混合，56°C，lmin，72°C， 3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收目的条带GAI1+GAI2+GAI3+GAI4。
[0052] 在设计引物时，GAI4引物的扩增片段包含了 GhGAM的DELLA和VHYNP结构域编 码序列以及结构域的临近序列。该结构域的临近序列相当于RNAi元件的必要组成一一间 隔序列，有利于两个反向重复序列形成双链RNA。
[0053] 最后用直接扩增发夹RNA的方法1以片段GAI1+GAI2+GAI3+GAI4为模板扩增获得 含间隔序列的4个GAI片段的反向重复序列。反应体系中含回收的GAI1+GAI2+GAI3+GAI4 约 5ng，2 μ L 引物 GAIIi-F (5 μ mol/L)，1 μ L 引物 GAMi-R (1 μ mol/L)，其余成分同常规扩增 体系。扩增程序为：94°C，5min ;94°(：，3〇86(：，56°(：，3〇86(3,72°(：，11^11，35个循环；72°(：延伸 3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收约ISOObp的目的条带，按常规方法回收、克隆和测序 验证，最终获得GAIsRNAi元件（图1)。
[0054] GAIsRNAi 元件依次包括 GAI1+GAI2+GAI3+GAI4 (包括 DELLA 和 VHYNP 结构域编码 序列以及结构域的临近序列）+GAI4反向重复序列+GAI3反向重复序列+GAI2反向重复序 列+GAIl反向重复序列。GAIsRNAi元件的序列如下，其中下划线所示为间隔序列：
[0055] gacgagttattagctgttttgggttacaaagttcggtcatcagatatggcggatgtagctcaaaaattg gaaatgttggagaaagttatgggtactgctcaagaaaatgggatttcacagcttggtgatactgttcattttaatcc ttcagatctatctggttgggttcaaaatttgttgatcgagttcgacgatgagcttttggcggttttgggttacaagg tcaaaacttcagacatggctgaagtggctcgaaagcttgagcggttggaggaggctatgtgtaatgttcaagatgat gggatttctcaccttgcttctgaaactgttcattataatccttccgatctgtcgacttggctcgagagcatgctctc tgaacttaacgatggactactcgccggtgctggttataaagtccggtcgtcggagctacgacaaatagctcagcgac tggaacgactcgaaaccgccatgggtaattcgcctgcagatttctctcaacttgcctccgatgccatactctataac ccttctgatctggcctgctgggtcgactcgctgctaactgagttcgctgaggatggttttctagccggagctggata cagagttaggtcatcggagctgcgaaaagtagctcagcgacttgaacgacttgaaaccgccatggttaattctcccg cagatttgtctcaacttgcttccgataccatccactataacccttccgatctagcctcctgggttgactcgctgctg tccaagtttactcagcctcctacttgtccctccgagtteatcatggatcctgaaaccaatcagacggtggtaagcga cgcatggaccactgccgaacctcatatgccgcaggtgcaccagaatatttcttaccagcaacaaagtttgaataatc agttaacggttgataatcagttaacggttgtaacagcaatggaggaagattccggtatacggttggttcatatgttg atgacgtgtgcggagtgcgttcaacgtggagacttctcattggctgagtaagctcggacagcagcgagtcaacccag gaagctagatcggaagggttatagtggatggtatcggaagcaagttgagacaaatctgcgggagaattaaccatggc ggtttcaagtcgttcaagtcgctgagctacttttcgcagctcggatgacctaactctgtatccagctccggctagaa aaccatcctcagcgaactcagttagcagcgagtcgacccagcaggccagatcagaagggttatagagtatagcatcg gaggcaagttgagagaaatctgcaggcgaattacccatggcggtttcgagtcgttccagtcgttgagetacttgteg taactccgacgaccggactttataaccagcaccggcgagtagtccatcgttaagttcagagagcatgctctcgagcc aagtcgacagatcggaaggattataatgaacagtttcagaagcaaggtgagaaatcccatcatcttgaacattacac ataacctcctccaactgctcaagctttcgagccacttcagccatgtctgaagttttgaccttgtaacccaaaaccgc caaaagctcatcgttgaactcgatcaacaaattttgaacccaaccggatagatctgaaggattaaaatgaacagtat caccaagctgtgaaatcccatcttcttgagcagtacccataactttctccaacatttccaatttttgagctacatcc gccatatctgatgaccgaactttgtaacccaaaacagctaataactcgtc
[0056] 实施例2纤维次生壁合成期特异的GAIsRNAi表达载体的构建
[0057] GAIsRNAi元件构建入植物表达载体p5的流程见图2。p5是由传统的植物表达载 体pBI 121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段（RB和LB之间区域，图2)替 换为了组成型的CaMV35S启动子（CaMV35S-P)控制报告基因⑶S和标记基因 NptII的融合 基因表达盒，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。
[0058] 按前述常规操作方法用引物（pFbl2F，5' -aagctTGCAGACTTAGGATTGGATG-3' 和pFbl2R，5' -ggatccGGTTAACCGAAATACAAAGCA-3'）从棉花基因组中扩增克隆启动子 pFbl2,并在启动子两端加上Hind