长旺盛的菌落用作后续发酵。PDA培养基:马铃薯200g/L、葡萄糖 20g/L、琼脂 20g/L,蒸馈水 100mL, pH 自然，121°C灭菌 15min。
[0027]3.突变菌株孢子悬浮液制备:以洗孢子的形式将PDA培养基上的菌株接入孢子悬液培养基培养48h。孢子浓度107CFU/mL。孢子悬液培养基:葡萄糖100g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.025g/L、硫酸锌0.lg/L、自然pH，121°C灭菌20mino
[0028](二)、玉米秸杆水解液制备:
[0029]取干重200g的玉米秸杆将其粉碎，过40目筛子，加入340g水，在球磨机的条件下对玉米秸杆进行湿磨Ih处理。取湿磨好的玉米秸杆与水按照1:6混匀，加入3mol/L硫酸使混合物的pH值保持在2-3，于120°C处理60min后，加入浓氨水中和pH至5.0。固液分离后将水解液通过旋转蒸发仪浓缩至浓度为100g/L，作为发酵碳源。
[0030](三)、发酵制备L-苹果酸
[0031 ] 1、以玉米秸杆水解液为原料发酵产L-苹果酸
[0032](I).发酵培养基制备:玉米秸杆水解液100g/L、硫酸铵浓度4g/L、硫酸镁0.30g/L、硫酸亚铁0.025g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸锌0.lg/L,中和剂碳酸钙80g/L(单独灭菌)，121°C 灭菌 20min，。
[0033](2).突变菌株发酵产L-苹果酸:取10L发酵培养基(2000g玉米秸杆)于15L发酵罐中，接种IL突变菌株孢子悬液，孢子浓度107CFU/mL发酵温度32°C、转速500r/min、通气量0.4L/ (L.min)，每隔12h取样测定L-苹果酸产量。
[0034]高效液相测定L-苹果酸产量:色谱柱Waters Carbohydrate (3.9mmX 300mm)，色谱仪 Waters 2695，检测器 Waters 2424,进样量 20 μ L，流速 0.8mL/min，流动相 20mmol/L磷酸氢二钾，柱温80°C，单次样品检测20min。
[0035]实验重复3次，结果如图4所示，每隔12h取样测定L-苹果酸产量，其发酵72h时L-苹果酸产量为60.15g/L0
[0036]发酵结束后固液分离，发酵液用碱性离子交换树脂D301进行吸附分离，pH3?4，温度20?30°C，流速2ml/min，水洗脱，得L-苹果酸水溶液，用高效液相色谱进行定性、定量分析。
[0037]2、以葡萄糖为原料发酵产L-苹果酸
[0038]以100g/L葡萄糖作为碳源，余及操作同上例1，每隔12h取样测定L-苹果酸产量，其发酵72h时产量为68.97g/L0
[0039]3、以木糖为原料发酵产L-苹果酸
[0040]以100g/L葡萄糖作为碳源，余及操作同上例1，每隔12h取样测定L-苹果酸产量， 其发酵72h时产量为40.27g/L0
【主权项】
1.一种玉米秸杆发酵制备L-苹果酸的方法，包括液体培养基的配制、灭菌、接种、发酵培养和分离，其特征在于:所述的液体培养基是以玉米秸杆水解液作为培养基的基材，浓度85-115g/L，同时添加硫酸铵3.5?4.5g/L、硫酸镁0.25?0.35g/L、硫酸亚铁0.020?0.030g/L、磷酸二氢钾0.45?0.55g/L、硫酸锌0.05?0.15g/L、碳酸钙70?90g/L ;培养基灭菌后接种米根霉菌突变株_2，孢子浓度16?10 7CFU/min，接种量8?12vt% ;所述的发酵培养是在发酵罐中于31?33°C、通气量0.35?0.45L/L.min条件下搅拌发酵70?75小时；所述的玉米秸杆水解液是过40目筛的玉米秸杆粉加入I?2倍量的水于球磨机中湿球磨I?2小时，然后转入水解釜中再加5?6倍量的水，并用硫酸溶液调pH值2?3，于110?130°C搅拌水解I?1.5小时；水解结束后用氨水调pH值4.5?5.5，固液分离后浓缩至浓度85?115g/L ;所述的米根霉菌突变株-2是利用同位素6°Co对出发菌株Rhizopusoryzae CICC41160进行诱变，诱变剂量10?30Gy，福照时间为20min ;福射后用丙稀醇浓度6ml/L平板筛选得突变株-1，将突变株-1再次6°Co辐照后接种于氟乙酸质量浓度为7g/L的平板上筛选得突变株-2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:液体培养基中各组浓度为玉米秸杆水解液100g/L、硫酸铵0.40g/L、硫酸镁0.30g/L、硫酸亚铁0.025g/L、磷酸二氢钾0.50g/L、硫酸锌 0.10g/L、碳酸钙 80g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:孢子浓度107CFU/ml，接种量10vt%。4.一种如权利要求1所述的方法中发酵用的米根霉菌突变株-2的选育方法，其特征在于: (1).利用同位素6°Co对出发菌株Rhizopusoryzae CICC41160进行诱变，诱变剂量10?30Gy，辐照时间20min，结合丙烯醇浓度为6ml/L平板筛选得突变株-1，将突变株-1再次6°Co辐照，10?30Gy，20min，接种于氟乙酸质量浓度为7g/L的平板上，筛选得突变株_2 ;该菌株即为突变菌株； (2).突变菌株活化培养:将突变菌株接种于PDA培养基中32°C培养l-2d，挑取菌落稠密，菌丝生长旺盛的菌落用作后续发酵；PDA培养基:马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L,蒸馈水 100mL, pH 自然; (3).突变菌株孢子悬浮液制备:以洗孢子的形式将PDA培养基上的菌株接入孢子悬液培养基培养48h ;孢子浓度16?10 7CFUAil ;孢子悬液培养基:葡萄糖100g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.025g/L、硫酸锌0.lg/L、自然pH，121°C灭菌 20mino
【专利摘要】一种玉米秸秆发酵制备L-苹果酸的方法，是以玉米秸秆酸水解液作为培养基的基材，也作为碳源，同时添加氮源、无机盐和中和剂作为液体培养基，灭菌后接种米根霉菌突变株-2于发酵罐中进行有氧发酵，固液分离后发酵液用碱性离子交换树脂D301吸附分离，水洗脱得L-苹果酸水溶液，米根霉菌突变株-2是以(Rhizopus？oryzae)CICC41160为出发的菌株，通过同位素60Co诱变孢子并结合丙烯醇和氟乙酸平板筛选得到突变菌株。本方法以玉米秸秆计，L-苹果酸的产量达3％，仅次于葡萄糖，与初始菌株发酵相比，L-苹果酸的产量提高了51.76％，杂质富马酸、琥珀酸的含量分别降低了90.12％和81.34％。
【IPC分类】C12N1/14, C12P7/46, C12N15/01, C12R1/845
【公开号】CN105018537
【申请号】CN201510474784
【发明人】李兴江, 孙婷, 杨英, 王海涛, 吴学凤, 刘亚, 李顺, 姜绍通, 潘丽军
【申请人】合肥工业大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月5日