Sh2结构域变体的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求2012年3月27日提交的美国临时申请号61/616, 167的权益，其内容在此 全文被引入本发明作为参考。
技术领域
[0002] 本发明整体设及蛋白酪氨酸激酶信号，具体的，本发明设及对含有憐酸酪氨酸的 肤或蛋白具有增强的结合亲和性的多肤，设及使用该多肤用于治疗蛋白酪氨酸激酶相关的 失调的方法，例如免疫学的和肿瘤学的失调，设及使用该多肤用于诊断蛋白酪氨酸激酶相 关的失调的方法，设及使用该多肤用于检测、追踪或监控细胞中的酪氨酸憐酸化事件的方 法，设及使用该多肤用于富集或纯化含有憐酸酪氨酸的肤或蛋白的方法，W及设及含有该 多肤的药物组合物。
【背景技术】
[0003] 蛋白酪氨酸激酶（PTKs)及其底物在多种细胞进程中起重要作用，例如增殖、分 化、运动和调亡。憐酸酪氨酸（还称为pTyr或pY)信号网中的异常激酶激活和伴随的改变 是多种癌症的标志。细胞用来翻译pTyr介导的信号的主要机制依赖于特异性结合酪氨酸 憐酸化蛋白的模块化蛋白结构域。Src同源区2(S肥）结构域是运些模块化结构域中最普遍 的，并在PTK信号途径中起核屯、作用。不同的pTyr位点使用不同的含甜2结构域的蛋白， 后者反过来激活不同的信号途径。
[0004]PTKs尤其包括受体酪氨酸激酶，包括表皮生长因子激酶家族成员。在多种恶性和 非恶性增殖性疾病中已有显示增强的PTKs活性。此外，PTKs在调节免疫系统细胞中起作 用是已知的。
[0005]PTKs是用于癌症治疗的重要药物祀点。目前的抗癌药主要基于小分子激酶抑制剂 或人源化抗体。运些药物经常显示对一组相关激酶的广谱特异性，患者在接受治疗1年左 右后最终对药物发展出耐受性。
[0006] 抑制PTK信号的替代想法是通过遮盖PTK底物的憐酸酪氨酸来阻断下游信号。虽 然憐酸酪氨酸特异性抗体对含pTyr多肤具有高亲和性，但是它们不能在细胞内使用。
[0007]pTyr特异性抗体（美国专利6,824,989)被广泛用来检测生物样本中含有的 pTyr。然而，抗体不能在活细胞内使用。IgG抗体分子是总分子量为~150kDa的异四聚化 蛋白，其通过免疫系统中的B细胞分泌至胞外空间。抗体含有二硫键，在免疫系统中的细胞 外部起作用，且没有被设计为在细胞质中起作用或透过细胞膜。因此，pTyr特异性抗体无 法被用作体内试剂用于在活细胞内部干扰设及蛋白酪氨酸憐酸化的胞内信号事件。
[0008] 含甜2结构域的蛋白在PTK信号下游起作用，且为信号集合点。甜2结构域含有~ 100个氨基酸且约比抗体分子小15倍。当分离的甜2结构域在细胞中递送或表达时，其能 够与结合pTyr位点的内生性信号蛋白竞争。然而，天然的甜2结构域被设计为介导与其同 源结合位点的瞬间相互作用，W确保动态细胞信号。换而言之，天然甜2结构域被内在地设 计为在体内不阻断PTK信号途径。由于该特征，天然SH2结构域无法用作强抑制试剂。
[0009] 美国专利号5, 786, 454("US454 ")公开了具有改变的结合位点的S肥结构 域，所述改变的结合位点改变了序列识别特异性。还有报道称对甜2结构域目标结合位 点的修饰，包括缺失、取代或引入非天然氨基酸，能够改变SH2结构域的序列识别特异性 ((Songyang等人，（1995)J.Biol.Qiem.,Vol. 270,卵.26029 ;Kimbe;r等人，（2000)Mol. Cell,Vol. 5,pp. 1043;Kaneko等人，（2010)Sci.Si即al. ,Vol. 3,卵.ra34;Virdee等人， (2010)Chemistry&Biology,Vol. 17,pp. 274)。通过该方法创造的甜2变体在一些情况下表 现出对其同源目标多肤的增强的特异性。然而，运些甜2变体通常W与对应的天然甜2结 构域相似的亲和性结合至其同源目标多肤。
【发明内容】
[0010] 本发明设及与亲代甜2结构域（包括野生型甜2结构域）相比，针对含憐酸酪氨 酸（"pTyr")的肤或蛋白具有增强的结合亲和性的变体甜2结构域，设及使用该变体S肥 结构域治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调（例如免疫学的和肿瘤学的失调）的方法，设及使 用该变体甜2结构域诊断蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法，设及使用该变体甜2结构域 追踪细胞中的酪氨酸憐酸化事件的方法，设及该变体SH2结构域在研究中作为亲和试剂或 检测试剂的用途，W及设及包含该变体甜2结构域的药物组合物。
[0011] 本发明还设及增强甜2结构域与含pTyr肤的结合亲和性的一般策略。残基取代 已被引入甜2结构域的pTyr-结合区域，并且阐述了对含pTyr肤的结合亲和性增强的有利 取代。不同的取代组合表现了对亲和性增强的不同程度的影响，并且所产生的变体甜2结 构域组（panel)显示了亲和性梯度。运些亲和性增强的变体在体外结合分析中和在哺乳动 物细胞系中表现出比野生型对照甜2结构域更紧密的与含pTyr的蛋白的结合。因此，变体 结构域在生理环境中和在体外条件下都起作用。
[0012] 在一个实施方式中，本发明提供了一种结合含憐酸酪氨酸（pTyr)肤的变体SH2结 构域。在一个实施方式中，变体甜2结构域包括在亲代甜2结构域的15个氨基酸位点的预 定义区域中具有至少一个氨基酸取代的亲代甜2结构域，该取代增强了变体甜2结构域相 对于亲代SH2结构域而言对含pTyr肤的亲和性。
[0013] 在本发明的变体甜2结构域的一个实施方式中，当所述亲代甜2结构域与SEQ IDNO: 1对齐时，亲代S肥结构域的15个氨基酸的预定义的区域对应于SEQIDNO: 1的 Argl8 (位点 1)、Lysl9 (位点 2)、Ala21 (位点 3)、Arg38 (位点 4)、Ser40 (位点 5)、Glu41 (位 点 6)、T虹42 (位点 7)J虹43 (位点 8)、Ala46 (位点 9)、Ser48 (位点 10)、Leu49 (位点 11)、 Se巧0 (位点 12)、Lys63 (位点 13)、His64 (位点 14)、和Lys66 (位点 15)。
[0014] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，该至少一个取代包括在亲代 SH2结构域中对应于位点10的位点处取代为小残基或疏水残基。
[0015] 在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中，该小残基或疏水残基包括丙氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸或鄉氨酸。
[0016] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，该至少一个取代包括在亲代 SH2结构域中对应于位点15的位点处取代为疏水残基。
[0017] 在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中，该疏水残基包括异亮氨酸、亮 氨酸或鄉氨酸。
[0018] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，该至少一个取代包括在亲代 SH2结构域中对应于位点10和15的位点处的取代。
[0019] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，该至少一个取代包括在亲代 SH2结构域中对应于位点8和15的位点处的取代。
[0020] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，该至少一个取代包括在亲代 SH2结构域中对应于位点8、10和15的位点处的取代。
[0021] 在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中，该对应于位点8的取代包括取 代为苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、或鄉氨酸。
[0022] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，变体甜2结构域包括位点4的 精氨酸残基、位点11的亮氨酸残基和位点12的丝氨酸残基。
[0023] 在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中，变体S肥结构域包括选自SEQ IDNOs: 5-17、19-22的氨基酸序列。
[0024] 在本发明的变体甜2结构域的另一个实施方式中，亲代甜2结构域是真核的 (eukaryotic)。
[0025] 本发明，在一个实施方式中，还提供了编码根据上述任一实施方式的变体甜2结 构域的分离的DNA序列。
[0026] 本发明，在一个实施方式中，还提供了含有前述实施方式的DNA序列的载体。
[0027] 在一个实施方式中，本发明提供了本发明的变体SH2结构域在治疗含pTyr肤相关 的失调中的用途。
[0028] 在另一个实施方式中，本发明提供了本发明的变体SH2结构域在抑制或预防细胞 中酪氨酸激酶的效果中的用途。
[0029] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于预防或抑制细胞中酪氨酸激酶的效 果的方法，其特征在于该方法包括将上述实施方式的变体甜2结构域递送或引入细胞中。
[0030] 在本发明的一个方面，在允许跨细胞运输的载体中提供变体SH2结构域。
[0031] 在本发明的另一个方面，变体甜2结构域作为融合至细胞膜穿透分子的产物而被 提供。
[0032] 在另一个实施方式中，本发明还提供了上述实施方式的变体甜2结构域在评估样 品中是否存在含pTyr肤中的用途。
[0033] 在一个实施方式中，本发明提供了评估样品中是否存在含pTyr肤的方法，该方法 包括（a)用所述样品接触本发明的变体甜2结构域，从而如果样品中存在含pTyr肤，会形 成含pTyr肤/变体SH2结构域复合物；和化）检测复合物的形成，从而检测样品中是否存 在含pTyr肤。
[0034] 在另一个实施方式中，本发明还提供了本发明的变体甜2结构域在含pTyr肤信号 途径的研究中和/或在分离含pTyr肤中的用途。
[0035] 在一个实施方式中，本发明设及一种用于从样品中分离含pTyr肤的方法，其特征 在于该方法包括：(a)用所述样品接触本发明的变体SH2结构域，从而如果样品中存在含 pTyr肤，会形成含pTyr肤/变体SH2结构域复合物；和化）从复合物中释放该含pTyr肤， 从而从样品中分离含pTyr肤。
[0036] 在前述方法的一个方面，该方法进一步包括通过检测所释放的含pTyr肤的量来 测定含pTyr肤在样品中的浓度。
[0037]在另一个实施方式中，本发明提供了一种测定含pTyr肤在样品中的浓度的方法， 该方法包括：(a)将本发明的变体甜2结构域固定在树脂上，化）将样品流经具有结合的变 体甜2结构域的树脂，（C)通过添加去除变体甜2结构域结合含pTyr肤的能力的溶剂，释 放结合到树脂上的任何含pTyr肤，从而产生洗脱组份，和（d)测定在洗脱组份中存在的含 pTyr肤的浓度。
[0038] 在本发明的各方面，含pTyr肤的浓度通过高效液相色谱0PLC)进行确定。
[0039] 在本发明的各方面，变体甜2结构域被结合至亲和性柱或侧流试纸条。
[0040] 在另一个实施方式中，本发明提供了本发明的变体SH2结构域在体外或体内的肤 或蛋白中结合或检测pTyr残基的用途。
[0041] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种制造相对于亲代SH2结构域而言具有增 强的含pTyr肤结合亲和性的变体甜2结构域的方法，其特征在于该方法包括取代亲代S肥 结构域的15个氨基酸位点的预定义区域中至少一个氨基酸残基，当所述亲代甜2结构域与 SEQIDNO: 1对齐时，亲代S肥结构域的15个氨基酸的预定义区域对应于SEQIDNO: 1的 Argl8 (位点 1)、Lysl9 (位点 2)、Ala21 (位点 3)、Arg38 (位点 4)、Ser40 (位点 5)、Glu41 (位 点 6)、T虹42 (位点 7)J虹43 (位点 8)、Ala46 (位点 9)、Ser48 (位点 10)、Leu49 (位点 11)、 Se巧0 (位点 12)、Lys63 (位点 13)、His64 (位点 14)、和Lys66 (位点 15)。
[0042] 在一个实施方式中，本发明提供了包含多个甜2结构域的多肤，该多肤中至少一 个所述多个甜2结构域为本发明的变体甜2结构域。
[0043] 通过参考下述附图，本发明的运些方面和其它方面根据发明详述将变得显而易 见。
【附图说明】
[0044] 根据本文给出的发明详述和伴随的附图，将更全面地理解本发明，运些发明详述 和附图仅W说明的方式给出，而不限制预期的发明范围。
[0045] 图1 (A)显示了围绕着pTyr的15个残基位点的位置和用于定义运些位点的序列 比对。
[0046] 图1做显示了pTyr在人巧nS肥结构域上的结合位点。原子坐标源自蛋白质数 据库ID: 1A0T(Mu化ern等，（1997)StrucUire,Vol. 5,PP. 1313)，其描述了巧nS肥结构域和 结合的含pTyr肤的结构。在此图中，为清楚起见，只有结合肤中的pTyr残基W插入的方式 进行了显示。围绕着结合pTyr的15个甜2结构域残基W深灰色阴影显示。甜2结构域的 骨架结构显示为条带状。15个残基的位置展示为球状。
[0047] 图2(a)显示了围绕着pTyr的15个残基位点的位置和用于定义运些位点的序列 比对。根据一个实施方式，该15个位点被定义在巧nS肥结构域上（图2a上阴影黑色残 基）。序列比对（图2a)包含人巧nSH2结构域（始于残基W149)、人SrcSH2结构域（始 于残基W151)和人Grb2S肥结构域（始于残基W60)。S肥结构域上的15个位点可从包括 人巧nSH2结构域的序列对齐中定义（图2a)。图2(b)说明了在对齐中存在对齐缺口时确 定15个位点的一个实施方式。根据图2(b)中所示的实施方式，位点4处的精氨酸首先定 义，然后位于位点4残基C端的位点5、6、7和8处的残基将分别被定义为第2、3、4和5个 残基。图2(c)显示了根据本发明对15个位点的编号和由Eck等定义的对应的编号系统的 对比（1993,化 1:ure，Vol. 362,PP. 87)。
[0048]图3列举了用于本发明的隧菌体展示筛选实验的含pTyr的合成肤。运些肤在其 N端生物素化，在其C端酷胺化。
[0049] 图4是显示根据本发明的一个实施方式获得的人巧nS肥结构域的63个变体的 15个位点的残基的表格。从野生型取代的残基为阴影黑色。
[0050] 图5是显示图4的63个变体中观察到的取代残基的列表。
[0051] 图6列举了用于本发明巧光偏振分析的含pTyr的合成肤。运些肤在其N端巧光 素标记，在其C端酷胺化。
[0052] 图7显示了测定FynS肥结构域和图5中列举的肤之间相互作用亲和性的溶液内 巧光偏振结合分析结果。图7 (a)显示了肤和含有如第一行所示取代的变体巧nS肥结构 域之间相互作用的解离常数化d)值（WyM为单位）。针对每个肤-变体组合计算了相对 于野生型的亲和性增强，如图7(b)所示。变体从左至右按照平均亲和性增强进行分类。
[0053] 图8显示了通过巧光偏振（AF巧的增加测定的野生型或变体巧nS肥结构域与肤 的结合曲线和1((1值。图8(曰）显示了野生型巧118肥结构域与巧光素-66口￥66肤669 10 NO:23)的结合。图8化）显示了T8V/S10A/K1化变体巧nS肥结构域与巧光素-GGpYGG肤 (SEQIDN0:23)的结合。图8(c)显示了在T8V/S10A/K1化变体SH2结构域和非憐酸化的 巧光素-GGYGG肤（SEQIDN0:24)之间观察到的不明显信号。
[0054] 图9是说明测定SrcS肥结构域和图5中列举的肤之间相互作用亲和性的溶液内 巧光偏振结合分析结果的表格。图9 (a)是显示含pTyr肤和野生型或变体SrcSH2结构域 之间相互作用的Kd值（WyM为单位）的表格。针对每个肤-变体组合计算了相对于野 生型的亲和性增强，如图9(b)所示。
[00巧]图10(a)是显示野生型SrcS肥结构域与巧光素-GGpYGG肤（SEQIDNO:23)的结 合曲线和Kd值的图。图10化）是显示T8V/C10A/K1化变体SrcS肥结构域与巧光素-GGpYGG 肤（SEQIDN0:23)的结合曲线和Kd值的图。
[0056] 图11显示了 8V/10A/1化取代的巧n、Grb2和SrcS肥结构域（称为TrM)与野 生型（称为Wt)结构域相比在EGFR下游细胞信号中的效果。甜2结构域与GFP融合并在 肥K293细胞中表达。图11 (a)是显示TrMS肥结构域比化结构域更紧密结合EGFR的蛋白 质印迹图。IP:免疫沉淀，IB:免疫印迹。图11(b)显示了在表达TrMS肥结构域的细胞中 Erk憐酸化被显著降低。Erk位于EGFR信号途径的下游。图11(c)是显示图11(b)中相对 于设定为100 %的GFP空载体对照的祀rk条带强度定量的图。
[0057] 图12显示了TrM(8V/10A/15k取代的）S肥结构域对肥K293细胞生长的抑制效 果。S肥结构域在肥K293细胞中作为GFP融合蛋白表达。图12(曰）是显示相对于6。口空载 体对照对细胞活性的抑制效果的图。图12(b)是显示通过软琼脂分析观察到的8V/10A/1化 取代的SH2结构域对菌落形成的抑制效果的图，其相对于GFP空载体对照定量。图12(c) 是图12(b)中定量菌落的示例照片。在图12(a)和12(b)中，黑条表示TrM，白条表示化。 相对于GFP空载体对照样品（设定为100% )计算数量。
[0058] 图13是显示TAT-S肥蛋白在细胞中转导的照片。对细菌表达的、纯化的 TAT-FynS肥结构域用FITC进行标记并与肥K293细胞一起在指示的浓度（列）和时间（行） 下培育。1虹培育后在2.5iiMS肥蛋白下观察到有效的蛋白输入（trans化Sion)。
[005引图14显示了如谷脫甘肤S-转移酶（GST)沉淀（pulldown)分析所示的，与化甜2 结构域相比巧nTrMSH2结构域的增强的结合酪氨酸-憐酸化蛋白的能力。I