剂部分具有荧光性质。
[0045] 在一个实施例中，所述指不剂部分是单独的焚光小分子或焚光团。所述"焚光团" 是指能引起分子发出荧光的分子组分。它是分子中的功能性基团，能吸收特定波长的能量， 并再以特定波长发射能量。通常的荧光团是异硫氰酸酯的荧光素（FITC)，罗丹明的衍生物 (TRITC)，香豆素，芘，青色素，马来酰亚胺的衍生物染料，CF染料，荧光探针染料，DyLight Fluors，0yester染料，Atto染料，HiLyteFluors，萤光素和AlexaFluors。焚光素酶，比 如萤火虫荧光素，当用萤火虫荧光素酶和ATP孵育时可以发光。所发射的光可被用于检测 Sirt5活性。
[0046] 在本发明的一些实施例中，所使用的荧光团产生的荧光强度或者发射波长会随着 荧光团和肽之间连接的存在或消失而变化，而且所述荧光强度或发射波长的改变可以被荧 光分光光度计检测出来。在一个实施例中，所述指示剂部分是氨基甲基香豆素。在一个优 选的实施例中，所述指示剂部分是7-氨基-4-甲基香豆素（AMC)。因此，Sirt5脱琥珀酰活 性的荧光底物的一个优选的例子是AMC-琥珀酰肽，比如，ISGASE(SuK) -AMC(其中SuK代表 琥珀酰赖氨酸），来自谷氨酸脱氢酶的肽序列。相似的，Sirt5脱丙二酰活性的荧光底物的 一个例子是AMC-丙二酰肽，比如ISGASE(MaK) -AMC(其中MaK代表丙二酰赖氨酸）。
[0047] 在另一个实施例中，所使用的荧光团产生的荧光强度或者发射波长不必须随着荧 光团和肽之间连接的存在或消失而变化，但是，底物肽也被淬火基团标记。比如，所述荧光 团可以和酰化赖氨酸肽的羧基末端相连，而所述淬火基团可以和含有酰化赖氨酸的肽链中 的不同氨基酸相连。由于底物中存在淬火基团，这些底物的荧光强度较弱。但是，当裂解剂 把所述肽赖氨酸残基的C末端裂解时，所述荧光强度提高。这个可以检测裂解的底物肽的 量。本发明中适宜的淬火基团包括DNP，BlackHoleQuencher?部分，和DABCYL。
[0048] 另外一个实施例中，所述指示剂部分是荧光小分子或荧光团，且属于供体-受体 对荧光团对中的一个。在这个实施例中，所述指示剂荧光团连接于酰化赖氨酸肽的羧基末 端（在"FRET"实施例中所述肽典型地包括在酰化赖氨酸的C末端有一个或多个氨基酸）， 供体-受体对荧光团对中的另一个分子位于附近，比如与所述肽底物的另一个氨基酸相 连。因此，在赖氨酸和指示剂部分之间的连接被裂解之前，所述邻近的供体-受体荧光团从 供体和受体间进行能量转移，所述能量转移可以被FRET检测。荧光共振能量转移（FRET) 是一个非辐射性的途径，在电子激发状态的分子通过FRET可以释放能量返回到更稳定的 基态。所述能量的转移发生于偶极-偶极相互作用的空间：如果两荧光团处于合适的距离， 能量能从激发态分子（供体荧光团）转移到邻近的分子（受体荧光团）。在这个实施例 中，Sirt5作用后，蛋白水解作用导致荧光团对中的一个分子对从底物上释放，使得荧光团 分离，降低了FRET信号强度，这与Sirt5活性具有相关性。
[0049] 为完成检测Sirt5活性实验，首先将含有Sirt5的样品与本发明所述合适的底物 接触，并在合适的条件下孵育。所述"样品"是指任何含有纯化，部分纯化或没有纯化的目 标Sirt5,而且可以是从细胞或组织中的溶解产物，或者Sirt5蛋白的产物（纯化自细胞或 组织或者是重组的表达系统）。在Sirt5样品和底物的孵育阶段后，将裂解剂同合适的反应 缓冲液加入反应中。在第二次孵育阶段以后，用水或其它中性pH缓冲液稀释，使用荧光检 测器在对所用荧光团所适宜的激发和检测波长下记录荧光。所述的信号强度与Sirt5具有 相关性。
[0050] 所述实验可以在微型板中进行。比如，将底物肽加到反应缓冲液中，随后将溶液加 入到可用于检测荧光的微型板的孔中，将板孵育。随后，将一小份Sirt5样品加入每个孔 中，在给定的时间内去酰化。然后，将一小份蛋白水解酶和合适的反应缓冲液加入到每个 孔，使用荧光酶标仪定时检测所述溶液的荧光强度。
[0051] 在一些实施例中，为避免与预测的Sirt5酶活性相关的底物肽不足，在实验中使 用过量的底物肽。优选的，为了在普通的生物样品中检测Sirt5活性，比如细胞核的提取 物，在反应中底物的浓度通常是1到200yM，更优选的，20到50yM。另一方面，所述裂解剂 的浓度可以主要根据所用底物肽的量进行调整。通常，所述裂解剂的量根据预测产生底物 肽的数量而调整，使在给定的条件下实现所述底物肽的充分裂解。优选的，所述裂解剂活性 要能够保证，比如即使所有使用的底物肽都脱乙酰化，都可以被裂解剂裂解时，在反应给定 的实验条件下在反应孵育中肽被充分裂解。优选的，当底物肽以0. 01到ImM浓度被用于反 应时，所用的胰蛋白酶数量，比如，每60y1反应液中通常为0. 2到5yg。更优选的，为每 60y1反应液中1到2yg。
[0052] 关于第一个反应（Sirt5引起的脱酰基化），反应的pH可以考虑选择Sirt5适宜的 pH值。例如，所述pH通常可以调整到6.0到8. 5,优选的，pH6. 8到8. 5。反应缓冲液可以 从能够提供上述给定的pH的缓冲液中进行选择。例如，Tris-HCl，Hepes-KOH，等可以被用 于本发明的方法中。更优选的，例如，可以使用20mMTris-HCl，pH7. 4。NAD是Sirt5需要 的共同底物，通常使用的浓度为〇. 5mM。优选的，在反应液中加盐和防腐剂。例如，往反应中 加ImM二硫苏糖醇（DTT)。第一个反应（Sirt5引起的脱酰基化）在35-40°C之间孵育2-20 小时。优选的孵育条件包括，例如，在37°C下，于含有NAD(0. 5mM)和DTT(lmM)的Tris-HCl 缓冲液（pH7. 4, 20mM)中孵育含有Sirt5的样品和底物的液体混合物4小时。
[0053] 使用裂解剂进行第二个反应，所述裂解剂和合适的反应缓冲液加入反应中。例如， 胰蛋白酶（1yg)和CaCl2(lmM)加入到反应中，在37°C下孵育大约3小时。
[0054] 胰蛋白酶孵育后，用水或其它中性的pH缓冲液稀释反应，使用荧光检测器在对所 用荧光团所适宜的激发和检测波长下记录荧光。所述的信号强度与Sirt5活性具有相关 性。筛选SIRT5调节剂的方法
[0055] 另一方面，本发明提供了一种筛选Sirt5脱丙二酰，脱琥珀酰或脱戊二酰活性的 调节剂的方法。
[0056] 所述筛选方法主要基于前面描述的评价Sirt5活性的实验，除了在有候选化合物 或者没有候选化合物的情况下进行实验。
[0057] 与没有候选化合物时的Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相比，在存在候选化合物 时，如果Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性减弱，此候选化合物被鉴定为Sirt5抑制剂。在存 在候选化合物时，与没有候选化合物时的Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性相比，如果Sirt5 脱丙二酰或脱琥珀酰活性增强，此候选化合物被鉴定为Sirt5激活剂。
[0058] 在所述筛选方法中被使用的测试化合物包括，例如，合成或重组的肽；低分子量的 合成化合物（小分子）；来源于动物，植物或细菌的细胞提取物；细胞培养上清液。
[0059] 脱丙二酰化或脱琥珀酰化实验和脱乙酰化实验联合使用来提高特异性
[0060] 如上所述的筛选Sirt5调节剂的实验可以包括一个补充的第二步脱乙酰活性的 实验，用来鉴别化合物可以调节Sirt5但不能调节Sirtsl-3或其它有脱乙酰活性的去乙酰 化酶。在这个第二部分实验中，例如，使用AMC-乙酰肽来鉴定被确认为是Sirt5调节剂的化 合物其调节Sirtsl/2/3的能力。在一个具体的实施例中，AMC-乙酰肽是ISGASE(AcK)-AMC 肽，其中AcK是乙酰赖氨酸。通过使用底物ISGASE(AcK)-AMC和Sirtsl-3任意一个，对被 确认为是Sirt5调节剂的化合物进一步进行测试。在第二部分实验中，化合物被发现可以 调节Sirt5活性，也可以调节Sirtsl-3任意一个活性，则其不被认为是Sirt5特异性调节 剂。然而，一个化合物被发现可以调节Sirt5活性，但不能调节Sirtsl-3任意一个活性，其 被认为是Sirt5特异性调节剂。因此，例如，使用AMC-琥珀酰肽的Sirt5实验，联合使用 AMC-乙酰肽的Sirtl/2/3实验，能用来筛选选择性调节Sirt5活性的化合物。
[0061] 所有实验都可以微型化，自动化以便用于高通量分析。所述实验能在一个或多个 分离的容器中进行；但是，本发明公开的实验的一个优点在于，能在一个容器中进行，比如， 微型板孔，其使用容易而且可以自动操作。如果需要的话，所述底物可以选择性地固定化在 固体介质上，比如通过生物素-链霉亲和素连接。
[0062] 本发明描述的合成底物的方法为现有技术。例如，在后续实施例中会描述在上述 公开的荧光实验中所用底物的合成方法。
[0063] 其它的检测方法
[0064] 本发明提供了另一个检测方法是质谱检测。这个实验中，Sirt5的活性是通过和 Sirt5接触后，测定底物肽的质量来鉴别的。比较起始物质（琥珀酰，丙二酰或戊二酰肽） 和产物（比如脱琥珀酰，脱丙二酰或脱戊二酰肽）的数量，这与底物上的Sirt5活性的量相 关。在这个实验中，产物的增加表明有Sirt5活性，产物很少或没有产物则表明Sirt5活性 很小或没有活性。
[0065] 通过使用质谱实验，候选化合物可以如下被鉴定为Sirt5抑制剂或Sirt5激动 剂。相对于没有候选化合物时产生的产物，当存在候选化合物时，产物减少（比如，脱琥珀 酰化，脱丙二酰化，或脱戊二酰化肽），则候选化合物被鉴别为Sirt5抑制剂。相对于没有候 选化合物时产生的产物，当存在候选化合物时，产物增加（比如，脱琥珀酰化，脱丙二酰化， 或脱戊二酰化肽），则候选化合物被鉴别为Sirt5激动剂。存在和不存在有调节作用的化 合物产生的活性的差异应该至少是20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，100 %， 200%，300%，400%，500% 或更多。
[0066] IC5。和EC5。
[0067] 候选化合物抑制Sirt5活性的能力可以通过确定其IC5。来表示。候选化合物激活 Sirt5活性的能力可以通过确定其EC5。来表示。本发明所使用的"1C5。"或者"一半最大抑 制浓度"是表示抑制一半的活性所需的化合物的量。可以通过构建剂量响应曲线，检测不同 浓度的化合物在降低或阻止酶活作用来确定化合物的IC5。。对于一个给定的抑制剂，IC5。可 以通过测定抑制一半最大酶活所需的浓度来计算。所述浓度的检测一般会形成S形曲线， 即在浓度相对较小的改变会造成快速增加。随着浓度增加效力减慢的点即为IC5。。根据现 有技术所知，可以通过对最佳拟合线求导来从数学上确定这个点。
[0068] 本发明进一步所使用的，"EC5。"或"一半最大有效浓度"是指引起基线和最大活性 之间的中点的强度反应时的化合物浓度。因此，递增的剂量响应曲线的EC5。表示其达到最 大作用50 %时的化合物的浓度。
[0069] 优选的，本发明Sirt5抑制剂抑制Sirt5的活性的IC5。小于或等于5yM。更优选 的，Sirt5抑制剂抑制Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的IC5。小于或等于5yM，而且 抑制Sirtsl-3脱乙酰活性的IC5。大于或等于100yM。化合物抑制Sirt5脱丙二酰化和脱 琥珀酰化的活性的IC5。小于或等于5iiM，而且抑制Sirtsl-3脱乙酰活性的IC5。大于或等 于100yM，则被认为是Sirt5特异性抑制剂。
[0070] 本发明Sirt5激动剂优选地激活Sirt5的活性的EC5。小于或等于5yM。更优选 地，Sirt5激活剂激活Sirt5脱丙二酰化和脱琥珀酰化的活性的EC5。小于或等于5yM，而且 激活Sirtsl-3脱乙酰活性的EC5。大于或等于100iiM。化合物激活Sirt5脱丙二酰化和脱 琥珀酰化的活性的EC5。小于或等于5yM，而且激活Sirtsl-3脱乙酰活性的EC5。大于或等 于100yM，则被认为是Sirt5特异性激动剂。
[0071] 可用于开展实验的试剂盒
[0072] 另一方面，本发明提供了一种检测样品中Sirt5活性的试剂盒，可筛选上述抑制 或增强Sirt5活性的化合物。所述试剂盒包括含有上述酰化赖氨酸的底物肽。
[0073] -个实施例提供了一种检测Sirt5活性的试剂盒，包括：（a)底物肽；(b)裂解剂， 它裂解底物肽的活性会随着底物肽的酰化水平的变化而变化。
[0074] 另一个实施例提供了一种能筛选抑制或提高Sirt5活性的化合物的试剂盒，包 括：(a)底物肽；(b)Sirt5 ; (c)裂解剂，它裂解底物肽的活性会随着底物肽的酰化水平的变 化而变化。通常，每个组分，（a)底物肽，（b)Sirt5,和（c)裂解剂是分开包装的。
[0075] 本发明中的试剂盒分开的组分通过组合实现最终适合反应的浓度。进一步说，除 了上述组分，所述试剂盒还可以包括提供合适反应条件的缓冲液。酶制剂和底物肽可以和 其它稳定蛋白的组分组合在一起。例如，优选的在制备液中加入使最终浓度是1 %的BSA和 多元醇，比如蔗糖和果糖，其最终浓度达0. 2到10%，优选的，1%，作为防止蛋白在冻干后 失活的成分。根据本发明所述试剂盒的每个组分可以是液体或干燥形式。本领域中常用的 洗涤剂，防腐剂，缓冲液等，可以加到上述组分中，只要他们不会阻碍脱酰化活性的检测。
[0076] 候选抑制剂的合成
[0077] 硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽通过形成停滞的共价中间体抑制Sirt5脱琥珀酰和 脱丙二酰活性。所述硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽参与Sirt5催化反应的第一步，形成不能 进一步反应的共价中间体。因为其它去乙酰化酶不能识别琥珀酰和丙二酰赖氨酸肽，所以 硫代琥泊酰和硫代丙二酰肽是Sirt5特异性抑制剂。
[0078] 在一个实施例中，所述候选化合物是小分子。所述的"小分子"是指小分子有机化 合物，比如，杂环，肽，糖类，留体之类的。优选的，所述小分子调节剂的分子量小于1500道 尔顿，1000道尔顿，，800道尔顿，或者甚至小于500道尔顿。所述化合物可以被修饰以提高 其性质，比如有效性，稳定性或者药学上的兼容性。在一个具体的实施例中，所述Sirt5抑 制剂是H3K9硫代琥珀酰（H3K9TSu)肽。硫代琥珀酰优选于硫代丙二酰是因为琥珀酰赖氨 酸比丙二酰赖氨酸具有更低的对Sirt5的KJ直。
[0079]SIRT5特异性抑制剂
[0080] 本发明提供了抑制Sirt5脱琥珀酰或脱丙二酰活性的化合物。所述Sirt5抑制剂 被描述具有下列通式：
[0081]
[0082] 在通式⑴中，&是负电荷（比如，阴离子）或可电离基团。负电荷或可电离基 团的例子包括羧酸盐（-C00 )，羧基（-C00H)，硫代羧酸盐（-CS0 )，磺酸盐（_S03 )，磷酸盐 (_P032 )，和硝基（_N02)。所述R2选自S，NR5,和0,其中，R5是氢原子⑶或含有1到7个碳 原子的烃基（比如，甲基，乙基，异丙基，苯基或苄基）。所述基团X。，XpX2,X3,X4,X5, 乂6和 X7独立的选自-(CH2)n-(其中n代表1，2,或3)，-謝5-，-0-，-5-，或键，条件是\-乂4中至 少一个不是键，并且X5-X7中至少一个不是键。通常，X5, &和X7是-CH2_基团或键，条件是 X5_X7中至少一个不是键。经常地，XQ-X3中至少一个，二个，三个或所有四个都是-CH2_基团， 而X4选自-CH2_，-NR5-，-〇-，或-S-基团。在具体实施例中，X(j-X3所有四个都是-CH2-基 团，但X4选自-CH2-，-NR「，-0-，或-S-基团，并且X5~X7S-CH「基团或键，条件是乂「父7至 少一个不是键。私和1?4基团独立的选自H，烃（R)，氨基酸，二肽，三肽，寡肽（比如，从4， 5,6,8,10,12或15个氨基酸残基到20, 25, 30, 35,40,45或50个氨基酸残基），蛋白质，核 碱基，核苷酸，二核苷酸，三核苷酸，寡核苷酸，单糖，二糖，寡糖，和保护基团（比如tBOC或 FM0C基团），或它们的组合物，或它们的修饰形式（比如，脂蛋白或核