安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗 传标记的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会经济的发展，我国生猪养殖规模化程度越来越高，各种疾病的预防和控 制变得更加重要和严峻。多种疾病给生猪养殖业的发展带来严重危害，造成经济损失，且从 遗传育种的角度衡量，也严重影响了猪种一些重要经济性状的遗传改良。因此提高猪群的 一般抗病力，可有助于降低生产成本，更有利于减少药物残留，提高猪肉产品质量、公共卫 生安全及动物福利等。研究发现，一些猪病的发病机制是和猪本身的遗传背景相关的，因此 应用遗传学方法，从遗传基础上提高猪对疾病的抗性具有治本的功效。以分子标记辅助选 择（MAS)和候选基因分析为标志的分子育种技术，使猪抗病育种研究成为可能。分子抗病 育种主要是借助MAS来提高选择的准确性，因此，寻找合适的分子标记和候选基因是关键。
[0003] TLR4是TLRs家族重要成员，是细菌脂多糖或脂质A识别的主要受体，能识别多种 革兰氏阴性病原菌、衣原体、螺旋体和病毒等病原微生物，触发激活特殊的信号途径，启动 和调节机体的免疫反应，其受体基因的遗传差异可造成机体对多种病原体抵抗力不一。猪 TLR4基因编码区全长2526bp，编码由841个氨基酸残基组成的多肽，由3个外显子组成，其 中外显子3最长，含有2265bp，外显子1和2长度分别为216和167bp。自其被克隆、测序 以来，研究者们就把猪TLR4作为疾病抗性的重要候选基因，研究其在呼吸系统、肠道系统 疾病以及天然免疫反应中的作用。邱小田等将猪TLR4基因定位在SSClq2. 9_q2. 13,并表明 TLR4mRNA在心、肝、脾、肺、肾各种组织中均有表达且在肺中的表达量最高，认为TLR4在肺 中的高表达与猪肺部疾病有关。包文斌等研究表明TLR4基因表达量的下调与F18大肠杆 菌抗性具有一定关系。Yang等在PK-15细胞内确定了猪TLR4基因g. 1605G > T变异导致 TLR4向下游传递信号的能力显著降低（P < 0. 01)。鉴于TLR4基因在动物机体免疫应答中 的重要性，对其多态性和遗传效应进行系统分析具有重要的理论和实践意义。
[0004] 断奶仔猪腹泻以及水肿病是当今规模化猪场养殖中一种常见的疾病。在仔猪的饲 养管理过程中，断奶是一个极其重要的环节。仔猪断奶后，由于断奶应激，仔猪自身消化系 统尚未发育完全，再加上来自母体的抗体来源终止等外界不良因素的影响，常常易导致仔 猪断奶后发生腹泻（Post-weaning diarrhea，PWD)和水肿病（Oedema disease，0D)，其中 F18大肠杆菌是最主要的致病源。至今为止，对于致病性大肠杆菌造成的危害，仍没有有效 的预防措施和治疗方法，给养猪业带来巨大的经济损失。
[0005] 本发明所述研究以安徽三个本地品种（圩猪、皖南黑猪及安庆六白猪）和一个外 来品种大白猪为试验对象，检测在该四个群体中TLR4基因的遗传变异。通过测定在易感染 F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标，进行品种间的差异分析、以及基因型间 的关联性分析，探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以及TLR4基因多态性对 不同种群断奶仔猪血清免疫指标的遗传效应。旨在寻找与安徽地方猪种断奶仔猪抗病力相 关的候选有效遗传标记，为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学 参考。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，本发 明方法具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。
[0007] -种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：
[0008] (1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪与外 来猪种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；
[0009] (2)样品米集：仔猪35日龄时，米集耳样组织并空腹米血；
[0010] (3)耳样组织DNA提取；
[0011] (4)PCR扩增Toll样受体4即TLR4基因目的片段；
[0012] (5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；
[0013] (6) PCR扩增产物双向测序；
[0014] (7)群体遗传学特性分析；
[0015] (8)仔猪血清免疫指标的测定；
[0016] (9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因的遗传变异与血清免疫指标的关联 性，并分析品种间血清免疫指标的差异性；
[0017] 根据TLR4基因单核苷酸多态性即single nucleotide polymorphism :SNP与免疫 指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影 响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的候选有效标记位点。
[0018] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤⑴中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪及大白猪 28日龄断奶仔猪分别选择100、105、92、132头，其中圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限 公司，皖南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，安庆六白猪采自望江安徽现代 良种养殖有限公司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。
[0019] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤（2)中耳样组织采集过程为：提前在1. 5mL的Eppendorf管中注入70%体积分数浓 度的酒精，然后每头猪采耳组织块1. 5g，装入所述Eppendorf管中，于-20°C保存备用。
[0020] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤（3)中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面毛发及 酒精，装入1. 5mL Eppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金 生物科技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至100ng/y L，放 在2-8摄氏度保存；④DNA纯度检测：取1 y L DNA在SMA 1000上测定0D260/0D280的比 值，当0D260/0D280比值在1. 8-2. 0之间说明所提DNA纯度较高；⑤质量检测：将所提DNA 用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量以便进行后续实验。
[0021] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤（4)中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤（3)获得的耳组织样DNA为模板，根据 GenBank猪TLR4基因外显子3序列，其登录号为AY753179,采用Primer Premier 5.0软件 设计2对引物，进行TLR4基因外显子3部分序列的克隆，并采用2%琼脂糖凝胶电泳检测 克隆产物是否为目的片段；其中引物TLR4 exon3-l的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO :2所示，引物TLR4 exon3-2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示，退火温度及目的片段长度见表1。
[0022] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤（5)中目的片段单链构象多态性的过程为：先将所述TLR4-exon3-l、TLR4-exon3-2 引物对的PCR扩增产物分别进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后分别进行硝酸银染色后 用凝胶成像系统观察电泳结果得到所述断奶仔猪TAP1基因单链构象多态性；
[0023] 其中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体包括如下步骤：
[0024] (A)清洗制胶所用的玻璃板、夹子、软绳、样品梳等用具，晾干；
[0025] (B)制板：将干净且干燥的底板磨面朝上，磨砂玻璃边的圆头朝下，用软绳封住玻 璃板的三面，夹子夹紧；
[0026] (C)配制10 %的聚丙烯酰胺凝胶72mL，双蒸水42mL，30 %的PAGE 24mL， 10 X TBE6mL，TEMED 50 y L，AP 330 y L，混匀后快速灌胶；
[0027] (D)将胶灌至玻璃板的边缘处后，插入梳子，此时注意检查胶中是否有气泡，在室 温下放置，待胶聚合后使用；
[0028] (E)凝胶聚合好后，向电泳槽中加入IXTBE，去下夹子、软绳及梳子，将玻璃板固 定于电泳槽上，并用注射器冲洗加样孔；
[0029] (F) 300V电压下预电泳30min ;
[0030] (G)取3 y L PCR扩增产物至96孔PCR板中，加入7 y L上样缓冲液，用枪吹打混匀 后，用透明胶带封口；
[0031] ⑶98°C变性lOmin，然后迅速冰浴lOmin，然后点样；
[0032] (I)240V电压电泳lh，150V电压电泳12h ;
[0033] 其中，所述硝酸银染色具体包括如下步骤：
[0034] (a)电泳完成后，取下玻璃板，小心取出凝胶并做好标记，用双蒸水漂洗2遍；
[0035] (b)倒入固定液，所述固定液为含10%体积分数乙醇和0. 5%体积分数乙酸的双 蒸水溶液，轻微振荡5min，回收固定液；
[0036] (c)倒入2%质量分数的硝酸银溶液避光轻微振荡15min，回收硝酸银溶液；
[0037] (d)用蒸馏水漂洗2遍后，倒入显色液，所述显色液为含3 %体积分数NaOH和 0. 1 %体积分数HCH0的双蒸水溶液，振荡进行显色反应，至条带清晰为止；
[0038] (e)蒸馏水漂洗，在凝胶成像系统中观察电泳结果。
[0039] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤（6)中PCR扩增产物双向测序的过程为：根据单链构象多态性结果，挑选不同带型的 样本，每种带型挑选3个样本，PCR扩增50 yL体系送至上海生工有限公司进行双向测序， 测序结果用DNAStar或DNAMan，Chromas软件分析。
[0040] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中， 所述步骤（7)中群体遗传学特性分析过程为：采用popgene软件对步骤（5)、（6)检测到 的SNPs位点进行群体遗传学分析，包括等位基因频率、基因型频率、纯合度、杂合度、有效 等位基因数、多态信息含量的计算，并用卡方检验来判断群体中基因型的分布是否处于 Hardy-Weinberg平衡、采用popgene软件进行x 2适合性检验计算。
[0041] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所 述步骤（8)中仔猪血清免疫指标的测定过程为：35日龄断奶仔猪空腹前腔静脉采血，常 规分离血清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪450nm处测质量浓度分别为 1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml、15. 6pg/ml共7个浓度 的标准品的吸光度，绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度；进而依照相对应的标准品的标 准曲线，依次计算血清中IL-6、IL-10、IL-12、IFN-y、TNF-a的浓度。
[0042] 本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中， 所述步骤（9)中采用的数学分析模型为：①品种间血清免疫指标的差异性分析采用 SPSS19. 0统计软件One-way AN0VA程序进行方差分析和显著性检验，试验所得数据均以 "平均数+SD"表示；②不同基因型对各免疫指标的效应差异分析采用的数学模型为 ：\,= y+Bi+Gj+ey其中，YlS为免疫指标表型值；y为群体均值；Bi表示断奶仔猪的断奶批次效 应；Gj表示第j种基因型效应；e ^表示随机误差；采用SPSS19. 0统计软件GLM程序对本试 验所检测到的遗传变异与血清免疫指标的关联性进行分析。
[0043] 本发明安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法与现有技术相比 具有如下有点：
[0044] 本发明所述方法以安徽省三个本地猪种（圩猪、安庆六白猪、皖南黑猪）和一个外 来猪种大白猪为试验对象，利用克隆、测序的方法检测在该四个群体TLR4基因外显子3序 列区的遗传变异。通过测定易感染F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标（血 清IL-6、IL-10、IL-12、IFN-y、TNF-a含量），进行品种间的差异分析、以及基因型间的