明显下降趋势。pH及可滴定酸测定 结果显示（图4)，在24h时，发酵液中pH达到最低值（4. 23)，此时发酵液中的可滴定酸度 也达到最大（41. 03mmol?L^，随着发酵时间的递增，发酵液pH逐渐上升，可滴定酸度逐渐 下降。
[0032] 实施例2温度对JW-SD2菌株解磷能力的影响
[0033] 按实施例1方法制备P.frederiksbergensisJW-SD2种子液。按1 %接种量向装 有50mLNBRIP培养基的100mL三角瓶中接入JW-SD2种子液，分别置于20°C、25°C、30°C、 35°C、40°C五个不同温度下进行震荡培养。每种温度处理均设立3组重复，以不接菌处理作 为空白对照。72h后测定发酵液中可溶性磷含量，研究温度对JW-SD2菌株解磷能力的影 响。
[0034] 随着培养温度的上升，P.frederiksbergensisJW-SD2菌株的解磷能力呈现先上 升后下降的趋势（图5)。在20°C到35°C的温度变化范围内该菌株表现出了较高的解磷能 力，当培养温度为30°C时，JW-SD2菌株解磷能力极显著（P〈0.01)高于其它温度处理，解磷 量达7. 79mmol?Li。当培养温度为20°C、25°C和35°C时，该菌株解磷量依次为5. 30、6. 74 和6.95臟〇1*1/。当培养温度为40°C，便检测不到该菌株的解磷活性。从结果可以看出， JW-SD2菌株能够适应较大幅度的温度变化，并发挥解磷效力。
[0035] 实施例3初始pH对JW-SD2菌株解磷能力的影响
[0036] 利用lmmol，LiCl或NaOH溶液分别调节培养基pH至4、5、6、7、8、9和10，培养基 其它成分保持不变。以1 %接种量向装有50mL培养基的100mL三角瓶中接入JW-SD2菌株 种子液。每种温度处理均设立3组重复，以不接菌处理作为空白对照。30°C震荡培养72h， 测定发酵液中可溶性磷含量，研究pH对JW-SD2菌株解磷能力的影响。
[0037] 结果如图6所示，随着初始pH的上升，P.frederiksbergensisJW_SD2菌株的解磷 能力表现出先下降后上升，后又下降的趋势，该菌株的解磷能力受到pH的显著影响。当初 始pH值为7时，该菌株具有最大的解磷能力，解磷量达7. 20mmol?!/，显著（P<0.01)高 于其它处理。当初始口11值为4、5、6、8、9、10时，，-302菌株解磷量依次为6.51、5.06、6.32、 6. 10、5. 56、0. 28mmol?Li。以上结果表明，JW-SD2菌株具有较强的酸碱度耐受性，能够在 大幅度变化的pH环境中发挥解磷作用。
[0038] 实施例4装液量pH对JW-SD2菌株解磷能力的影响
[0039] 在100mL三角瓶中分别装入20、40、50、60和80mLNBRIP培养基，使得装液量与三 角瓶体积比分别为1/5、2/5、1/2、3/5和4/5。按1 %接种量分别接入JW-SD2菌株种子液进 行震荡培养。每种装液量处理均设立3组重复，以不接菌处理作为空白对照。30°C震荡培 养，72h后测定发酵液中可溶性磷含量，研究装液量对JW-SD2菌株解磷能力的影响。
[0040] 如图7所示，P. frederiksbergensis JW-SD2菌株在装液量为1/5时具有最高的不 溶性矿质磷酸盐溶解量，7. 41mmol吨\显著（P<0. 01)高于其它装液量处理。在装液量 分别为2/5、1/2、3/5、4/5时，该菌株仍具有较好解磷能力，解磷量分别为4. 20、4. 99、4. 10、 3. 16mmol *Li。装液量直接反应了培养基溶氧水平，说明JW-SD2菌株能够在较大溶氧范围 内发挥其解磷能力。
[0041] 实施例5盐离子浓度对JW-SD2菌株解磷能力的影响
[0042] 向NBRIP培养基中分别按质量百分比浓度0%、1.0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%、 5. 0%、6. 0%、7. 0%和8.0%加入NaCl，保持培养基其它成分不变。以1%接种量向装有 50mL培养基的100mL三角瓶中接入JW-SD2菌株种子液。每种NaCl浓度处理均设立3组重 复，以不接菌处理作为空白对照。30°C震荡培养72h，测定发酵液中可溶性磷含量，研究盐离 子浓度对菌株解磷能力的影响。
[0043] 结果如图8所示。随着NaCl浓度的增加，该菌株的解磷能力出现了先上升后下降 的变化趋势。该菌株在NaCl浓度1. 0%时具有最大的解磷量，7. 25mmol*Li。在NaCl浓度 为0到3. 0%之间时，该菌株的解磷能力保持在5. 02mmol*L1以上。从上述结果可以看出， JW-SD2菌株具有较好的NaCl耐受力，这对其在高盐土壤中发挥解磷作用具有重要意义。
[0044] 实施例6JW-SD2菌株促进NL895杨树苗木生长试验
[0045] 将-80°C保存的P. frederiksbergensis JW-SD2菌株活化2次后，接种于LB培养 基，30°C，180r/min培养20h，发酵液菌体浓度为10scfu .mLi。取lmL发酵液5000Xg离心 5min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，将菌体重新悬浮于lmL灭菌生理盐水中，制备成接 种液。
[0046] 分别采用灭菌土和非灭菌土进行NL895杨扦插苗（Populuseuramericana cv.) 培植，土壤采集自南京紫金山，40天后选取长势相近的杨树苗作为接种对象，接种前测量 杨树苗苗高、地径，作为第一次测定结果。采用灌根法向每株杨树苗接入10mL上述接种 液，对照处理杨树苗接入10mL灭菌蒸馏水，接种与对照处理分别设立5组重复，接种后杨 树苗置于同一温室环境下生长，适时使用灭菌水浇水。分别于接种后50、100、150天进 行第二（H2，D2)、三（H3，D3)、四次（H4，D4)苗高地径测量，计算增长率。增长率（％ )= (Yn-Yj-any^-Yw)X10(V(Yn(ck)-Yckl)，（Y=H或者D，H为苗高，D为地径，n= 2,3,4)。
[0047] 结果如图9和表1所示，接种JW-SD2菌株能够显著的促进杨树苗木的生长 (P〈0. 05)。接种第50、100、150天时，灭菌土中接种处理的杨树苗苗高增长率分别比对 照高出33. 16 %、27. 17 %和12. 28%，地径增长率分别比对照高出15. 73%、19. 79 %和 14. 84%;非灭菌土中接种处理的杨树苗苗高增长率分别为42. 61 %、38. 15%和19. 02%，地 径增长率分别为 14. 82%，20. 27%和 14. 26%。说明P.frederiksbergensisJW-SD2 菌株无 论在灭菌土或非灭菌土中对杨树苗的促生效果均较好，且能够持续促进杨树苗木的生长。
[0048] 表 1Pseudomonas frederiksbergensisJW-SD2 菌株对杨树生长的影响
[0049]
【主权项】
1. 一株杨树根际解磷细菌，其分类命名为JW-SD2， 已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2015350,保藏日期为：2015年6月 2日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。2. 权利要求1所述的杨树根际解磷细菌/3. JW-SD2在促进杨树 苗木生长中的应用。3. 权利要求1所述的杨树根际解磷细菌/3. JW-SD2在溶解难溶 性无机磷酸盐中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的无机磷酸盐为磷酸钙。5. 权利要求1所述的杨树根际解磷细菌/3. /reoferiAsAerwasis JW-SD2的解磷方 法，其特征在于：将/3. /reoferiAsAergeasis JW-SD2菌株在LB培养基活化，30°C，180r/min 培养至菌体浓度为10s cfu ? mL 1的种子液；按1%接种量将JW-SD2菌液接入含磷的NBRIP 培养基，20-35°C，pH4-10,并向NBRIP培养基中添加质量百分比浓度0%-3. 0%的NaCl，180 r ? min 1进行震荡培养解磷48-96h。6. 权利要求5所述的杨树根际解磷细菌/3. JW-SD2的解磷方法， 其特征在于：30°C，pH7,加入I. 0%NaCl，180 r ? min 1进行震荡培养解磷72h。
【专利摘要】本发明公开了一株杨树根际解磷细菌JW-SD2及其应用，该杨树根际解磷细菌的分类命名为<i>Pseudomonas？frederiksbergensis</i>？JW-SD2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC？M？2015350，保藏日期为：2015年6月2日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。该菌株对土壤中的磷酸三钙具有较强的溶解能力；该菌株对温度、酸碱度、盐度等土壤环境因素具有良好的适应能力，能够在复杂的环境条件下发挥其解磷能力；通过盆栽试验证实接种JW-SD2菌株，能够显著的促进NL-895杨树苗木的生长。因此，该JW-SD2是一株优良的生物菌肥资源菌株，具有良好的应用开发潜力和前景。CCTCC M 201535020150602
【IPC分类】C12N1/20, C05G3/00, A01P21/00, C12R1/38
【公开号】CN105062910
【申请号】CN201510419230
【发明人】吴小芹, 曾庆伟, 叶建仁, 刘辉
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月16日