广。
【附图说明】
[0021]图1表示重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO和预测人尿酸酶pHUO、狒狒尿酸酶PUO,鼠尿酸酶RU0、犬尿酸酶⑶O的氨基酸序列比对图；图中显示出JBUO改造的若干位点。
[0022]图2表示重组人/狒狒嵌合尿酸酶JBU0、犬尿酸酶⑶0、狒狒尿酸酶PUO的SDS-PAGE电泳图；图中主要显示35kDa左右的单体带和70kDa左右的二聚体条带。
[0023]图3表示测定尿酸UA浓度的标准曲线。
[0024]图4表示测定重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBU0、犬尿酸酶⑶0、狒狒尿酸酶PUO的催化活性。
【具体实施方式】
[0025]下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
[0026]实施例1
一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的重组表达方法，包括如下步骤:
(I)、根据优化后的JBUO的核苷酸序列(序列表I)设计引物，需要包含酶切位点，从5'-3'排列如下所示:
JBPI:GGAATTCCATATGGCCCATTATCACAACGACTATAAGAAJBP2:CCGCTCGAGttaCAGGCGGCTACTCAGTTTGCGT引物稀释成50pmol/ μ I，然后进行PCR步骤。
[0027](2)、利用Tag酶进行PCR步骤，琼脂糖凝胶电泳检测JBUO条带位于100bp左右，胶回收目的基因，用Nde I和Xho I将基因酶切成粘性末端，同样处理pET-26b载体，加入T4 DNA连接酶，4°C连接12小时，转化大肠杆菌DH5 α。用硫酸卡那霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-26b-JBU0载体。
[0028](3)、将正确的pET-26b-JBU0质粒转化大肠杆菌BL21，用硫酸卡那霉素-LB平板筛选出单斑克隆，在5ml LB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37°C培养至0D600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，20°C培养16小时(时间延长会显著提高产量)，离心收集菌体，保存于_20°C或者立即进入下步纯化。
[0029](4)、用pH 7.5的Tris缓冲溶液洗涤混合后的菌体沉淀，用20_40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，用冰水混合物环境下超声破菌(4s超声，8s间歇，全长30min，保护温度30°C )，16000rpm/min离心20min，收集沉淀。
[0030](5)、用ρΗ10-ρΗ11的Na2CO3缓冲溶液充分溶解沉淀，并加入ImM的PMSF防止蛋白酶解。再次16000rpm/min离心20min，收集上清。此时所得溶液为高浓度的含有JBUO蛋白的溶液。可以进行含量测定和活性检测。
[0031]实施例2
一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的纯化方法，包括如下步骤:
(I)、选择合适载量的阴离子交换柱，用0.1M的pHll的Na2CO3缓冲溶液平衡柱材，将实施例I制备的含有JBUO蛋白的溶液缓慢上柱。
[0032](2)、用0.1M的pH8.5的NaHCO3缓冲液洗脱杂蛋白，至少清洗5倍柱材体积；然后逐渐将缓冲液的NaCl盐浓度提升到1.5M，并再清洗5倍柱材体积，充分洗脱其它杂质。
[0033](3)、用pHll的Na2CO3缓冲溶液流穿柱材，并逐渐将缓冲液的NaCl盐浓度提升到1M，收集洗脱下来的JBUO蛋白。
[0034](4)、将纯化后的JBUO蛋白上分子筛进行聚合形式鉴定，出峰位置约为140kD，为四聚体形式。
[0035]上述重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的活性检测方法如下:
(I)、配置不同浓度的尿酸溶液，浓度从I μ M到500 μ Μ，测定尿酸溶液的Α292ηΜ标准曲线，如图3所示。
[0036](2)、配置反应缓冲溶液为三乙醇胺盐酸缓冲液，pH8.9。3ml的反应体系中加入100 μ M尿酸，加入总量为50 μ g的JBUO蛋白酶或对照蛋白酶，然后在30°C条件下反应5min，最后用IM KOH终止反应，测定292nM下的吸光度。
[0037](3)、尿酸氧化酶的活性定义为，在标准条件下30°C时，每分钟催化I μ mo I尿酸氧化所需的酶量为I个国际单位IU。计算各样品酶活。
[0038]上述纯化后的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白在作为制备治疗痛风或者高尿酸血症的药物中的应用。该药物为经PEG化的原核表达载体表达出的活性尿酸酶蛋白，该活性尿酸酶蛋白的氨基酸序列同序列表2。
[0039]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
【主权项】
1.一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于: 氨基酸序列如下:MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPffKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKffRYHQGRDVDFEATffDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRLο2.一种含有重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的制备方法，其特征在于:将权利要求1所述的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白对应的核苷酸序列插入原核表达载体或者真核表达载体进行表达。3.根据权利要求2所述的含有重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的制备方法，其特征在于:所述原核表达载体pET-21、pET-26或者pET_28。4.根据权利要求2所述的含有重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的制备方法，其特征在于:将该蛋白对应的核苷酸序列插入大肠杆菌表达载体进行表达，用ρΗΙΟ-pHll的碱性缓冲液溶解蛋白进行快速纯化。5.根据权利要求4所述的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的制备方法:其特征在于:具体步骤如下: (1)、根据优化后的JBUO的核苷酸序列设计引物，需要包含酶切位点，从5'-3'排列如下所示:JBPI:GGAATTCCATATGGCCCATTATCACAACGACTATAAGAAJBP2:CCGCTCGAGTTACAGGCGGCTACTCAGTTTGCGT 引物稀释成50pmol/ μ I，然后进行PCR步骤； (2)、利用Tag酶进行PCR步骤，琼脂糖凝胶电泳检测JBUO条带，胶回收目的基因，用Nde I和Xho I将基因酶切成粘性末端，同样处理pET-26b载体，加入T4 DNA连接酶，连接后转化大肠杆菌DH5 α ;用硫酸卡那霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-26b-JBU0载体； (3)、将正确的pET-26b-JBU0质粒转化大肠杆菌BL21，用硫酸卡那霉素-LB平板筛选出单斑克隆，在LB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中培养至0D600为0.4-0.6，加入IPTG储液，培养后离心收集菌体，保存于_20°C或者立即进入下步纯化； (4)、用Tris缓冲溶液洗涤混合后的菌体沉淀，用溶菌酶配合TritonX-100帮助裂解细菌，用冰水混合物环境下超声破菌，离心后收集沉淀； (5)、用pH10-pH 11的Na2COgl冲溶液充分溶解沉淀，并加入PMSF防止蛋白酶解；再次离心后收集上清，此时所得溶液为高浓度的含有JBUO蛋白的溶液。6.一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白溶液的纯化方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)、选择合适载量的阴离子交换柱，用0.1M的pH 11的Na2CO3缓冲溶液平衡柱材，将含有JBUO蛋白的溶液缓慢上柱； (2)、用0.1M的pH8.5的NaHCO3缓冲液洗脱杂蛋白，至少清洗5倍柱材体积；然后逐渐将缓冲液的NaCl盐浓度提升到1.5M，并再清洗5倍柱材体积，充分洗脱其它杂质； (3)、用pHll的Na2CO3缓冲溶液流穿柱材，并逐渐将缓冲液的NaCl盐浓度提升到1M，收集洗脱下来的JBUO蛋白； (4)、将纯化后的JBUO蛋白上分子筛进行聚合形式鉴定，出峰位置约为140kD，为四聚体形式。7.权利要求1所述的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白在作为制备治疗痛风或者高尿酸血症的药物中的应用。8.一种治疗痛风或者高尿酸血症的药物，其特征在于:该药物为经PEG化的原核表达载体表达出的活性尿酸酶蛋白，该活性尿酸酶蛋白的氨基酸序列同权利要求1所述。
【专利摘要】本发明公开了一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白序列、制备工艺及其应用。该尿酸酶蛋白简称为JBUO，源自狒狒尿酸酶蛋白序列，并进行了人源化的突变和增强活性的突变，使其同时具有免疫原性低和催化活性高的特点。将JBUO密码子优化后，克隆到原核表达载体中，转化大肠杆菌，收获重组蛋白量可达10mg/每克干菌，同时JBUO的生物学活性大于6？IU/mg。本发明可高效、快速的获得与人体高度同源的低免疫原性的新型尿酸酶纯品，广泛用于制备治疗与人体高尿酸相关疾病的药物、食品等产品，具有极高的使用价值。
【IPC分类】C12N9/06, A61P19/06, C12N15/53, C12N15/70, A61K38/44
【公开号】CN105062987
【申请号】CN201510555258
【发明人】杨霞
【申请人】山西锦波生物医药股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月1日