火焰南天竹的转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种火焰南天竹的转基因方法。
【背景技术】
[0002] 火焰南天竹（NandinadomesticaFirepower)是一种新兴的园林绿化树种，现在 大量用于园林景观中。火焰南天竹耐寒常绿，叶片椭圆或卵圆形，与原种披针形叶有明显区 另IJ，这是优于原种的重要性状。火焰南天竹到每年秋天遇到冷空气，叶色便由绿色转为鲜红 色，叶片颜色能够持续到第二年初春，因此在南方地区具有极佳的观赏效果。在园林绿化 中，火焰南天竹可与山茶同时培植于树坛中，也适宜种植在植物群落下层，丰富景观层次。 同时，它又是一种具有良好发展前途的盆栽植物，并有较高的药用价值。火焰南天竹颜色随 温度降低逐渐变红，一年四季均呈红色的品种还没有发现，培养四季均呈红色的品种具有 更好的市场前景。随着近年来分子生物学和基因工程的飞速发展，通过转基因技术来进行 分子改良育种是非常方便快捷的育种手段。
[0003]目前还未有关于火焰南天竹的转基因报道，在其他物种的转基因方法主要有农杆 菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是迄今为止植物转基因研究中研 究最为成熟最常用的一种转基因方法。虽然在其它植物中的有比较成熟的转基因体系，但 是传统方法费事费力，耗时间长，操作繁琐而且效率很低，获得的转基因植株太少，给转基 因植株的后期鉴定工作带来了障碍。而且由于物种不同转基因的方法也不同，借鉴其它植 物的转基因方法成功率很低，因此如何获得一个高效快速的火焰南天竹稳定转化体系，是 火焰南天竹转基因中亟待解决的一个问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷而提供一种高效快速稳定的火焰南天 竹的转基因方法，转化率可达10%以上。
[0005] 为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的：
[0006] 本发明所述的火焰南天竹的转基因方法，包括：
[0007] (1)将外源质粒载体转入农杆菌LBA4404中，获得重组农杆菌；
[0008] (2)活化培养所述的重组农杆菌至0D600为0? 4~0? 6,然后侵染火焰南天竹的叶 片外植体50~70min;
[0009] (3)侵染后的叶片外植体依次经诱芽培养、生根培养获得火焰南天竹植株，从火焰 南天竹植株中筛选得到转基因火焰南天竹。
[0010] 本发明以火焰南天竹的叶片为外植体，选用农杆菌LBA4404做为侵染菌株，采用 合适的菌液浓度和侵染时间，能够成功获得转基因火焰南天竹，且转化率可达10%以上。进 一步优选的，步骤（2)中，活化培养所述的重组农杆菌至0D600为0. 4,然后侵染火焰南天竹 的叶片外植体60min;
[0011] 优选的，所述的外源质粒载体为PCAMBIA2301或携带外源基因的pCAMBIA2301。
[0012] 优选的，侵染前，对所述的叶片外植体进行预培养。所述预培养的温度为22~ 26°C，时间为7~9小时，光照为2000~3000LX。进一步的，所述预培养的温度为25°C，时 间为8小时。一般，预培养的培养基为MS。
[0013] 优选的，所述的叶片外植体为0. 2~0. 6cm2的叶块。
[0014] 优选的，所述侵染的方法为：使所述的叶片外植体浸没在重组农杆菌菌液中，每隔 3~7min摇动菌液。
[0015] 优选的，侵染后，吸干所述的叶片外植体表面的菌液后进行诱芽培养。
[0016] 优选的，所述诱芽培养的培养基为添加抗生素、蔗糖、琼脂、TDZ2~3mg/L和 2, 4-D0. 1~0. 3mg/L的MS培养基。进一步优选的，诱芽培养的培养基中，蔗糖的浓度为 30g/L，琼脂的浓度为5. 5g/L，TDZ的浓度为2. 5mg/L，2, 4-D的浓度为0? 2mg/L。
[0017] 优选的，所述生根培养的培养基为添加抗生素、蔗糖、琼脂和NAA0. 3~0.5mg/L的 1/2MS培养基。进一步优选的，生根培养的培养基中，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为 5. 5g/L，NAA的浓度为 0? 4mg/L。
[0018] 本领域人员可以知晓，在诱芽培养和生根培养的培养基中，抗生素的种类和浓度 根据外源质粒载体所携带的抗性基因而确定。
[0019] 优选的，步骤（3)中，叶片外植体经诱芽培养后获得无根植株，对所述的无根植株 进行鉴定，筛选出的转基因无根植株，再对转基因无根植株进行生根培养。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0021] 本发明采用较低的侵染农杆菌菌液浓度（0D600值为0. 4~0. 6)，较长的侵染时间 (50~70min)，能够减少农杆菌和其他杂菌污染，同时又提高了侵染效率。
[0022] 本发明侵染农杆菌菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂，减小对火焰南天竹 叶片外植体的伤害，提高叶片外植体培养的成活率和再生率，而传统方法中常添加乙酰丁 香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片外植体造成伤害，降低叶片外植体的再生能力。
[0023] 本发明使用携带强表达报告基因的载体PCAMBIA2301，通过观察可直接筛选得到 转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作，缩短了转基因的周期。
[0024] 本发明建立了一个高效、快速、稳定的火焰南天竹遗传转化体系，转化率可达到 10 %以上，为进一步应用遗传转化方法改良火焰南天竹品种提供实践基础，有利于今后火 焰南天竹分子育种工作的发展。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价 形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0026] 本发明【具体实施方式】采用的材料如下：
[0027] 1、植物材料
[0028] 火焰南天竹组培苗。
[0029] 2、培养基
[0030] 培养基的配方如下：
[0031] 火焰南天竹继代培养基（代号SI) :MS+ZT0? 6mg/L+IBA0? 2mg/L+葡萄糖15g/L+ 琼脂粉 6g/L，pH5. 7 ;
[0032] 火焰南天竹转基因苗培养基（代号S2) :MS+蔗糖30g/L+琼脂5. 5g/L+TDZ2. 5mg/ L+2, 4-D0? 2mg/L+ 卡那霉素 20mg/L+ 羧苄青霉素 400mg/L，pH5. 7 ;
[0033] 火焰南天竹转基因苗生根培养基（代号S3) :1/2MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂 5. 5g/L+NAA0. 4mg/L+ 卡那霉素 20mg/L+ 羧节青霉素 400mg/L，pH5. 7 ;
[0034] YEB固体培养基：牛肉浸膏5g/L、酵母膏lg/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、MgS04*7H20 0? 4g/100ml和琼脂I. 5g/100ml，PH7. 4 ;
[0035] YEB液体培养基：牛肉浸膏5g/L、酵母膏lg/L、蛋白胨5g/L、鹿糖5g/L和 MgS04 ? 7H20 0. 4g/100ml,PH7. 4 ；
[0036] 所有的培养基均高压灭菌，冷却备用。
[0037] 3、菌株和植物表达载体
[0038] 本发明中使用的侵染菌株是农杆菌菌株LBA4404,该菌株