一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。
【背景技术】
[0002]蓝莓(Vaccinium spp.)是一种新兴果树，近年来在许多国家广泛栽培，是发展十分迅速的优良果树之一。英国权威营养学家将蓝莓列为15种健康食品之首，联合国粮农组织也将蓝莓列为人类五大健康食品之一。蓝莓作为一种营养丰富，具有巨大保健功能和极高经济价值的果树，必将在人民生活水平不断提高的今天受到越来越多的关注。随着科学的不断发展和技术的不断革新，蓝莓的研究必将逐步深入，其潜在的功效将被不断得到开发和利用，为人类的健康增添风采。蓝莓在国外研究起步较早，目前我国对蓝莓的研究也正飞速发展，但由于起步较晚，对于蓝莓各方面的研究还不够深入。许多分子生物学方面问题都值得我们进一步地研究。分子生物学研究热点中转基因的研究一直是热点问题之一，也是难点，尤其是蓝莓这种新兴的果树。目前很少有蓝莓转基因的相关报道，仅有的几个使用的方法也都是传统方法，转化效率低，周期长，不能够满足飞速发展的蓝莓分子生物学研究的需要。
[0003]目前常用的蓝莓基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是蓝莓遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟最常用的一种转基因方法。由于蓝莓叶片偏小，操作起来比较困难，而且蓝莓叶片组织致密，不容易诱导愈伤组织，也不容易诱导再生芽，因此传统的农杆菌介导法在蓝莓转基因中效率非常低。获得的蓝莓植株转基因效率不到浅千分之一。因此如何获得一个高效快速的蓝莓稳定转化体系，是蓝莓转基因中亟待解决的一个问题。
[0004]蓝莓品种‘美登’丰产性好，品质优良，适于设施栽培，目前国内大范围的栽培次品种，本发明就是在已经建立的‘美登’蓝莓叶片再生体系的基础上，对影响根癌农杆菌转化蓝莓叶片的各项因素进行了研究，优化各种参数，简化操作过程，确定最佳转化条件。过程中选用了基于gataway技术的超表达载体，使得转基因后的检测工作更加便利，更加快速，从而建立了一个高效、快速、稳定的‘美登’蓝莓遗传转化体系，为进一步应用遗传转化方法改良蓝莓品种提供实践基础，有利于今后蓝莓分子育种工作的发展。
[0005]我们仍然面临这些需要解决的问题:解决农杆菌和杂菌的污染问题；解决蓝莓转化效率低的问题；解决蓝莓转基因中叶片褐化死亡的问题，缩短转基因周期；简化检测方法，加快检测速度。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明采用了基于gataway技术的超表达载体，简化了转基因后的检测过程，建立高效、快速、稳定的‘美登’蓝莓遗传转化体系，为进一步应用遗传转化方法改良蓝莓品种提供实践基础。本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。
[0007]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤:
I)菌种活化:将含质粒PK7WG2D农杆菌AGLO在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 °C培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 V, 220 rpm在摇床中振荡培养至0D600值0.4 ;常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mL改良WPM液体培养基重悬菌体，在摇床中振荡培养大约I小时测定0D600值为0.2?0.3之间；
2)植物材料准备:取蓝莓美登组培苗上幼嫩、平展的35?40天叶龄的叶片，从叶片中间横切一刀，将叶片切为两段；
3)预培养:将剪好的蓝莓叶片放置于培养基S2上预培养3天，这个过程能够使蓝莓叶片尽可能吸水，软化叶片；
4)侵染:预培养完成后将叶片放入悬浮的菌液中，在恒温摇床中150转每分钟的速度轻微摇匀，浸染40分钟，过程中一直摇动，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；
5)共培养:侵染后的叶片接种在蓝莓共培养基S2中，25°C培养箱中黑暗培养3天；
6)洗叶片:因此共培养完成后将叶片放置于含有300mg/L羧苄青霉素和的300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗叶片10分钟，清洗完成后用无菌滤纸吸干水分；
7)愈伤诱导:清洗完成的蓝莓叶片，接种在蓝莓筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 °C，先暗培养21天，然后光照培养，培养40天左右，蓝莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，将发光的愈伤挑出，转入下一步的芽诱导培养基；
8)芽诱导:将诱导完成的愈伤组织接种在蓝莓芽诱导培养基S4上，培养室中光照培养，培养20天左右，遇上组织上会有小芽长出，继续培养，芽慢慢长成植株，叶片清晰可见，此时在体式荧光显微镜下进行观察，明显看出叶片有非常亮的绿光发出，而有一部分植株没有发光将发光的植株挑出，转入下一步的根诱导培养基；
9)根诱导培养:抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入蓝莓生根筛选培养基S5上生根，获得完整的抗性苗，此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。
[0008]以上步骤完成以后可以获得稳定遗传的转基因植株。此方法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。
[0009]其中，所述培养基S2为改良的WPM培养基添加蔗糖30g/L，琼脂5.5 g/L、TDZ6mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60°C左右分装平板备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾 500 mg/L、(NH4) 2S04硫酸铵 200 mg/L、MgSO 4.7Η20 400 mg/L^ KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20 四水合硫酸锰 20 mg/L、ZnSO4.7H20 七水合硫酸锌 8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L, CaCl2.2H20100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸Img/L、维生素 B1.5 mg/L、维生素 B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。
[0010]其中，所述培养基S3改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L、植物凝胶2.5 g/L、玉米素lmg/L、TDZ lmg/L、2, 4_D 0.4mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500mg/L、(MM)2SO4硫酸铵 200 mg/L、MgSO 4.7H20 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20四水合硫酸锰20 mg/L, ZnSO4.7H20七水合硫酸锌8 mg/L,氏803硼酸5 mg/L,乙二胺邻二轻基乙酸铁10 mg/L、CaCl2.2H20100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸I mg/L、维生素B1.5 mg/L、维生素 B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。
[0011]其中，所述诱导培养基S4改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，ZT(玉米素)3mg/L，TDZ lmg/L，，pH5.4，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素350 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500mg/L、(MM)2SO4硫酸铵 200 mg/L、MgSO 4.7H20 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4.4H20四水合硫酸锰20 mg/L, ZnSO4.7H20七水合硫酸锌8 mg/L,氏803硼酸5 mg/L,乙二胺邻二轻基乙酸铁10 mg/L、CaCl2.2H20100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸I mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素 B61 mg/L、维生素 C2 mg/L。
[0012]其中，所述要生根筛选培养基S5改良的1/2WPM培养基添加蔗糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L, IBA 0.6mg/L, ρΗ5.8，高压灭菌，冷却至60°C加入羧苄青霉素300 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4) 2S04硫酸铵200 mg/UMgSO4.7Η20 400 mg/L ^ KH2PO4 200mg/L、KI LI mg/L、MnSO4.4H20 四水合硫酸锰 20 mg/L、ZnSO4.7H20七水合硫酸锌8 mg/L, H3BOjHI 5 mg/L,乙二胺邻二羟