一种靶向真菌细胞壁几丁质合成酶下调剂细胞筛选模型的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种靶向真菌细胞壁几丁质合成酶下调剂高通量 药物细胞筛选模型。
【背景技术】：
[0002] 几丁质合成酶是几丁质生物合成中的关键酶，而由微生物产生的几丁质合成酶抑 制剂能抑制该酶的活性，阻止几丁质的生物合成，从而抑制真菌生长或阻止昆虫幼虫和蛹 蜕皮达到杀虫效果。由于哺乳类动物没有几丁质代谢系统，所以筛选几丁质合成酶抑制剂， 有望开发出对人、畜低毒无害的新型抗真菌剂和杀虫剂。
[0003] 在各类几丁质合成酶中，CS3(IV类）在细胞周期开始时，在细胞出芽位点处合成 几丁质环；CS2(II类）在有丝分裂末期，在母细胞和子细胞之间合成初级隔膜，而CSl(I 类）则是在细胞分裂后起修复损伤作用；所以在研究中，本发明靶向选择CS3(IV类）作为 筛选靶标。
[0004] 迄今，已有诸多关于靶向几丁质合成酶进行真菌药物筛选模型的报道（邓乔.重 庆.西南大学研究生院.2014-4-1)，而相关研究多集中于几丁质酶抑制剂的研究。由于药 物筛选靶标特异性有限，所述研究筛得的药物化合物多存在交叉耐药的问题。本项研究将 筛选靶向锁定于几丁质生物合成上游酶基因调控序列，这种全新的构思可以大大提高筛得 几丁质合成酶抑制剂未来应用的潜能。
【发明内容】
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[0005] 本发明提供一种靶向真菌细胞壁的几丁质合成酶下调剂高通量筛选模型。所 述的筛选模型由UMc sh5基因启动子序列UMPRO、携带荧光素酶报告基因的重组质粒 Ppic9KG-UMPR0-LUC、稳定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株GS115-UMPR0-LUC、筛选试剂 以及荧光素酶报告基因检测系统构成。
[0006] 所述的UMcsh5基因是植物真菌致病菌黑粉菌属Ustilago maydis521chromosome 6中的几丁质合成酶编码基因，Genbank号为NC_026483 ;
[0007] 优选地，所述的几丁质合成酶启动子序列UMPRO为SEQIDNo: 1所示的DNA序列；
[0008] 优选地，所述的构建重组质粒采用载体Ppic9K ;
[0009] 优选地，所述的筛选试剂包括氨苄青霉素和遗传霉素。
[0010] 本发明提供的一种靶向真菌细胞壁的几丁质合成酶下调剂高通量筛选模型，是利 用UMcsh5基因UMPRO启动子序列作为药物筛选的靶标，通过UMPRO启动子-单荧光素酶报 告基因检测系统，根据荧光素酶作用于其底物所发出生物荧光的强度，判断UMPRO启动子 的活性，根据化合物对启动子的抑制效果，判断几丁质合成酶下调活性。所以，本发明所提 供的细胞模型筛选系统，可以高效、高通量地用于不同来源化合物的筛选。能够抑制UMPRO 启动子活性，使荧光素酶报告基因表达降低的化合物，即有可能成为抑制几丁质生物合成 的候选药物。
[0011] 本发明提供的一种靶向真菌细胞壁的几丁质合成酶下调剂高通量筛选模型的构 建，包括以下步骤：
[0012] 1?改组载体Ppic9KG的制备
[0013] 将Ppic9k载体经由BgI II与SacI双酶切处理后，跑胶、纯化回收片段长度为 9000bp左右的片段，即得Ppic9KG ;
[0014] 2.UMcsh5基因启动子序列UMPRO的扩增
[0015]利用NCBIGenbank号为NC_026483UM521 菌中UMcsh5 基因启动子区序列 1500bp 作为UMcsh5基因启动子UMPR0。应用primerprimer5.0引物设计软件，设计UMPRO启动子 的引物，以人工合成的启动子序列UMPRO为模板进行PCR，扩增得到的目的片段；
[0016] 3.荧光素酶报告基因（LUC)的扩增
[0017] 应用primerprimer5.0引物设计软件，设计焚光素酶报告基因（Luc)的引物，以 pGL4. 17 (购置于promega公司）模板进行PCR，扩增得到的目的片段；
[0018] 4.携带荧光素酶报告基因的重组质粒的构建
[0019] 将步骤2中的启动子序列UMPRO经由BgI II与SacI双酶切处理后，与Ppic9KG 连接后，转化、提取质粒获得Ppic9KG-UMPR0重组子；随后，将步骤3中的荧光素酶报告基因 (LUC)与Ppic9KG-UMPR0重组子经SnaBI和NotI双酶切后连接、转化、提取质粒DNA得到重 组质粒Ppic9KG-UMPR0-LUC ;
[0020] 5.稳定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株GS115-UMPR0-Luc的筛选
[0021] 将重组质粒电转入毕赤酵母细胞GS115中，经不含组氨酸的筛选培养基和含遗 传霉素的培养基双筛选，根据荧光素酶报告基因检测结果，获取表达强度最高的单克隆细 胞株，扩大培养获得GS115-UMPR0-LUC单克隆细胞株。
[0022] 6.药物筛选的应用
[0023] 在GS115-UMPR0-LUC单克隆细胞株培养过程中，加入候选化合物，作用24小时后， 利用并根据荧光素酶报告基因检测荧光强度，来反应启动子UMPRO的活性，进而获得对几 丁质合成酶启动子的有抑制作用的化合物。
[0024] 发明优点：
[0025] 1、本发明是一种基于UMcsh5基因启动子序列UMPRO的几丁质合成酶下调剂筛选 模型。几丁质生物合成是真菌细胞中很重要的一个合成路径，它的缺失在很大程度上会影 响真菌细胞的活性。所以，基于对UMPRO启动子的活性影响作为靶标，具有很好的实用性；
[0026] 2、本发明所述筛选模型选用稳定表达UMPRO启动子活性的单细胞菌株，筛选结果 具有均一、可靠、高效迅速、操作简便的特点，能够满足高通量筛选的要求；
[0027] 3、本发明所述筛选模型是选用荧光素酶作为报告基因，通过该检测系统，依据荧 光素酶强度反应启动子UMPRO的活性，进而显示化合物对几丁质合成酶启动子的抑制作 用，灵敏度高、效果直观；
[0028] 4、本发明所述筛选模型可应用于不同化合物，包括天然化合物、合成化合物、有机 小分子、无机小分子、糖类、脂类中的一种或几种，其应用范围广、筛选效率高、成功几率大。
[0029] 5、本研究中将筛选靶向锁定于几丁质合成酶的上游调控序列，不同于目前对几丁 质酶抑制剂的研究，全新的构思可大大提高获得几丁质生物合成抑制剂应用的潜能。
【附图说明】：
[0030]图I-Ppic9KG_UMPR0-LUC重组质粒的构建
[0031] 图2 -GS115-UMPR0-LUC单克隆细胞株荧光素表达强度的检测
[0032] 图3-化合物Fl-FlO相对荧光素酶检测结果
[0033] 实施方式：
[0034] 以下结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释 而不是限定。
[0035]《实施例1》Ppic9kG-UMPR0_LUC重组质粒的构建
[0036] 1.1引物设计
[0037]UMPRO-F：GAAGATCTTGTAGCATGTACCTTGGTCGAGCCA
[0038]UMPRO-R：CGAGCTCAGCAAGCGAAAAGCCTCCCATG
[0039]LUC-F：TACGTAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA
[0040]LUC-R：ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTTAGACGTTGATCCTGGCGCTG
[0041] 1. 2改组载体Ppic9KG的获得
[0042] 将Ppic9K载体（购置于Invitrogen)经由BgIII与SacI(购置于Takara)双酶 切处理后，跑胶、纯化回收片段长度为9000bp左右的片段，即得改组载体，命名为Ppic9KG;
[0043]I. 3UMcsh5基因启动子序列UMPRO的获取
[0044]利用NCBIGenbank号为NC_〇26483Ustilagomaydis52lchromosome6 中的UMcshf5 基因前启动子区序列约1500bp，应用primerprimer5. 0引物设计软件，设计UMPRO启动子 的引物UMPRO-F和UMPR0-R，以人工合成的启动子序列UMPRO(委托中美泰和生物技术有限 公司合