表达和分泌人干扰素α2b的乳杆菌菌株及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及人干扰素a2b的表达质粒及表达该 蛋白的遗传工程菌株。
【背景技术】
[0002] 大部分病毒，包括人乳头瘤病毒（HPV)和人单纯疱疹病毒（HSV)，通常在粘膜表面 处侵入宿主。HPV感染已经成为世界范围内的流行病，仅在美国每年就有超过600万起新病 例。世界上每年有数百万妇女被发现与HPV感染有关的可能是癌症前期的、异常的宫颈涂 片。对于与HPV感染有关的宫颈病变，尚无可行的药物治疗手段。作为替代，人们努力实行 外科或其他切除技术来破坏被感染组织并预防疾病进一步发展。由于不希望的副作用，这 些做法通常只限于较晚期患者。宫颈糜烂是另一种因HPV宫颈感染引起的常见病症。临床 上，宫颈糜烂与鳞状上皮细胞的部分或完全丧失有关。尽管已有新疫苗可预防HPV的初始 感染，但是仍有数百万妇女被预期会感染HPV并发生癌症前期的宫颈病变，另外全世界已 有数百万妇女被感染。
[0003] 目前预防宫颈HPV感染的主要方法是预防性HPV疫苗。例如Merck&Co.公司以及 GlaxoSmithKlineInc.公司已经开发出旨在防护HPV数种特异性亚型的感染的疫苗，分别 称为Gardasil?和Cervarix。尽管这些疫苗具有带来显著医疗进步的可能性，然而它们主 要是为了提供一种手段来预防青少年初始感染，而不是治疗已经发生感染的患者。这些疫 苗主要意在预防而非治疗，从而限制了其应用范围。此外，它们的有效范围和持续时间具有 明显的限制。例如，Merck成功地开发了G效rdasil?,用于9-26的女孩/妇女对HPV的防 护，但只针对HPV的6型、11型、16型和18型。HPV-16引起约50%的宫颈癌，而16型、18 型、31型和45型一共引起80%的癌症。因此，Oardasil?或其他疫苗并非对所有可能导 致癌症的HPV亚型有效。
[0004] 生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒1型（HSV-I)和单纯疱疹病毒2型（HSV-2)引起的， 全球发病率较高。虽然大多数感染者无症状，但也有感染者出现严重的临床表现，尤其是免 疫缺陷患者。生殖器溃疡在世界范围内都很普遍，其中50%-80%可分离到HSV。在许多国 家，HSV-I血清型阳性率超过80 % -90 %，15岁-49岁的全球人口中有16 %以上感染HSV-2。 在美国，HSV-I的感染率为约58%，HSV-2为16%。HSV的复发，定义为HSV再活化并导致 明显的临床症状。原发性生殖器HSV-I的复发率为57%，HSV-2为89%。生殖器HSV-I感 染的患者平均每年有1. 3次复发，而HSV-2感染每年的中位复发次数为4次。HSV-2的较高 复发率再次反映了特异性。
[0005] 鉴于该疾病的严重性，生殖器疱疹的预防和治疗十分关键。HSV疗法在过去十几年 的中流砥柱是三个抗病毒药物：阿昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦。这些核苷类似物，其抑制 病毒DNA聚合酶，可以在症状初现（即7-10天）和复发（S卩1-5天）时服用，以及每日服 用抑制病毒。虽然该方案可减轻病变的严重程度和降低脱落率，但并不能消除脱落和传播 风险。治疗性疫苗是另一个潜在的治疗措施。事实上，许多早期的HSV疫苗试验研究基本 上是不成功的。因此，需要新的治疗方法。
[0006] 干扰素是一组人体天然存在的抗病毒感染的细胞因子。干扰素已被用于治疗许多 病症，包括病毒或细菌感染。人干扰素（IFN)a2b是I型IFNa家族的一员，具有许多生物 学作用，包括广谱抗病毒效应、抑制肿瘤细胞增殖和增强免疫功能。基于IFNa2b的疗法已 用于治疗宫颈上皮内瘤变IChakalova 2004}和皮肤鳞状细胞癌{Edwards, 1992}。对于这 些治疗，重组IFN-a2b通过全身给药患者。这些治疗经常需要较高的药物剂量、严格的药 物保存条件和高昂的生产费用。
[0007] 由于健康个体的粘膜密布着以乳杆菌属（Lactobacillus)(每克液体IO7-IO9CFU) 为主的共生细菌{Sobel，1996}，因此可利用这些细菌来递送小蛋白或肽以防止粘膜传播病 毒在这些位置处的传播。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一方面提供了一种表达IFN-a2b蛋白的质粒，其通过将SEQIDNo:1 的人成熟IFN-a2b编码区（编码C-末端24-188位氨基酸残基）克隆到pOSEL144 中的NheI和MfeI位点而获得，所述质粒中的基因表达盒包括P23启动子、卷曲乳杆菌 (Lactobacilluscrispatus)S-Iayer基因从核糖体结合位点到信号肽酶切割位点的信号 序列以及在3'末端带有TAA终止密码子的IFN-a2b蛋白编码区，所述基因表达盒的序列 如SEQIDNo:2 所示。
[0009] 本发明的第二方面提供包含本发明第一方面的表达质粒的宿主细胞。
[0010] 在一个实施方案中，所述宿主细胞的亲代细胞是乳杆菌细胞。
[0011] 在一个优选实施方案中，所述宿主细胞的亲代细胞是詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii)阴道分离株1153。
[0012] 本发明的第三方面提供一种pUC18erm衍生质粒，其通过将SEQIDN〇:2的人 IFN-a2b基因表达盒克隆到pUC18erm衍生载体的XbaI位点而获得，所述衍生载体包含詹 氏乳杆菌1153的poxlDNA的片段（~2. 8kb)，并在中点通过定点突变引入防止形成融合蛋 白的框内终止密码子和唯一的XbaI限制酶切位点。
[0013] 本发明的第四方面提供一种乳杆菌，其染色体中整合有SEQIDN〇:2的人 IFN-a2b基因表达盒，所述乳杆菌（分类命名为詹氏乳杆菌（Lactobacillusjensenii)) 已于2014年10月30日以保藏号CGMCCNo. 9872保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)， 该保藏单位位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0014] 在一个实施方案中，所述第四方面乳杆菌通过将本发明第三方面的质粒转化到亲 代乳杆菌中与亲代宿主细胞的染色体DNA发生同源重组及分离而获得。
[0015] 在一个优选实施方案中，所述亲代乳杆菌是詹氏乳杆菌阴道分离株1153。
[0016] 本发明的第五方面提供包含本发明第四方面的乳杆菌的药物。
[0017] 在一个实施方案中，所述药物是阴道栓剂、阴道活菌胶襄或预充式推进器。
[0018] 本发明的第六方面提供本发明第四方面的乳杆菌用于制备预防或治疗HPV、HSV 感染或相关癌症的药物的用途。
[0019] 本发明的第七方面提供包含本发明第四方面的乳杆菌作为佐剂的疫苗。
[0020] 本发明的第八方面提供本发明第四方面的乳杆菌作为疫苗佐剂的用途。
【附图说明】
[0021] 图I. (A)p0SEL5651表达质粒的结构示意图。人成熟IFN-a2b编码区DNA片段， 经内切酶NheI和MfeI消化后，替换掉pOSEL144 {Chang, 2003}中的2DCD4DNA片段，所得 质粒被命名为P0SEL5651。表达盒含有乳酸乳球菌的P23启动子、卷曲乳杆菌CbsAss和干 拢素基因；(B)通过DNA同源重组将干扰素基因表达盒插入詹氏乳杆菌菌株1153染色体中 poxl基因的过程图；（C)野生型詹氏乳杆菌1153菌株（第2泳道）及其IFNa2b重组菌株 (第3泳道）的基因组DNA的poxl基因PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳。第1泳道代表 IkbDNA梯度分子量标准（Invitrogen)。
[0022] 图2是詹氏乳杆菌1153中人IFN-a2b的表达。将包含表达质粒p0SEL5651的詹氏 乳杆菌1153菌株，以及包含空质粒的詹氏乳杆菌1153菌株在Rogosa肉汤培养基（Difco、 Detroit、MI)中培养。将收集的分泌到200y1无细胞Rogosa培养基中的蛋白用TCA沉淀、 热变性并在还原性SDS-PAGE中分离（分别点样5、10和20y1)。将分离的蛋白电转染至聚 偏氟乙稀（PVDF)膜上，然后参照人IFN-a2b标准品（InSight)通过抗IFN的mAb检测詹 氏乳杆菌产生的人IFN-a2b。在独立试验中使用多种浓度的人IFN-a2b参照标准品确认 乳杆菌产生的人IFN-a2b的表达水平。
[0023] 图3是含染色体单拷贝IFN-a2b基因表达盒的重组詹氏乳杆菌1153菌株的生产 速度的评估。将重组菌株1153-IFN(poxl: :IFN-a2b)和野生型詹氏乳杆菌1153分别接种 于100mlMRS，并于37°C培养。在多个时间点测定每毫升菌液中活菌数以确定生长曲线。
[0024] 图4是含染色体单拷贝IFN-a2b基因表达盒的重组詹氏乳杆菌1153菌株的乳酸 生产的评估。将重组菌株1153-IFN(poxl: :IFN-a2b)和野生型詹氏乳杆菌1153分别接种 于100mlMRS，并于37°C培养。在多个时间点测定D-乳酸生产量（克/升，g/L)。
【具体实施方式】
[0025] 人IFN-a2b是较小并且对酸稳定的蛋白，表达IFN-a2b的詹氏乳杆菌可以生长 在或定殖到人阴道粘膜上，用作干扰HPV、HSV病毒侵