利用小球藻表达人干扰素基因的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种利用小球藻表达人干扰素基因的方 法。 技术背景：
[0002] 干扰素具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节的功能，临床应用非常广泛，市场需求量 巨大。目前，临床上应用的干扰素主要是原核表达系统生产的重组蛋白，但原核表达系统存 在下游提取纯化工艺复杂、成本高等缺陷，寻找新的表达系统成为药用蛋白研究和生产的 热点。小球藻特别是蛋白核小球藻作为一种营养丰富且繁殖快的真核单细胞藻类，是安全 的新资源食品，作为药用蛋白表达系统有着天然的优势。
[0003] 利用农杆菌转化小球藻的研究是近年才出现的，2012年，Cha等[1]利用根癌农杆 菌介导转化的方法将PCAMBIA1304质粒上的T-DNA区转入普通小球藻（C.vulgaris)，并且 研究了预培养时间，共培养的时间、PH值、温度，以及乙酰丁香酮浓度和农杆菌OD值对转化 的影响。2013年，马瑞娟等[2]利用根癌农杆菌介导转化的方法将pCAMBIA2301-idi的T-DNA 区转入普通小球藻（C.vulgaris)，并成功获得转化子，且转化子叶黄素产量较野生型有明 显提尚。
[0004] 用于转基因植物筛选的选择基因通常是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。常 用到的抗生素抗性基因有新霉素磷酸转移酶基因（NptII基因），潮霉素磷酸转移酶基因 (HptII基因）和氯霉素乙酰转移酶（CAT基因）等。陈颖、王逸云、cha等[3'4'1]人的试验 说明不同的小球藻对抗生素的敏感性也不同，故如何来选择一个小球藻较敏感的抗生素以 及对应的选择基因是也是当前的一个重要课题。
[0005] 用于转基因植物基因表达检测的报告基因主要包括P-葡萄糖苷酶基因（⑶S基 因）、荧光素酶基因（Luc基因）、绿色荧光蛋白基因（GFP基因）以及冠癭碱合成酶基因等。 Cha等在转基因小球藻检测到了绿色荧光蛋白的表达。
[0006] 利用小球藻获得干扰素就必须得到转干扰素基因的小球藻，小球藻的遗传转化是 获得转基因小球藻的途径。在众多遗传转化方法中，通过根癌农杆菌Ti质粒构建的外源基 因转化体系是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化方法，但是如何建立 起一种稳定而高效的根癌农杆菌介导的小球藻遗传转化体系的关键所在。
[0007] 蛋白核小球藻的培养基为BG-11+lOg/L葡萄糖，用100mg/L的潮霉素筛选转化体。 为了提高外源基因在小球藻中的表达效率，优化并人工合成干扰素（HuIFN-a2b)基因，构 建人工合成干扰素基因与绿色荧光蛋白融合表达的植物表达载体PCAMBIA1304-IFN，利用 根癌农杆菌AGL-I介导的方法成功转化蛋白核小球藻，并获得稳定遗传的小球藻转化体。 通过PCR和RT-PCR的验证，检测HuIFN-a2b基因转入蛋白核小球藻并在转录水平得到了 表达；WesternBlot和荧光显微镜观察鉴定融合蛋白在蛋白核小球藻转化细胞内成功表 达。
【发明内容】
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[0008] 本发明就是要提供一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，用小球藻的偏好密 码子对人干扰素（HuIFN-a2b)基因序列进行优化改造并人工合成该基因，构建人工合成 干扰素基因与绿色荧光蛋白基因融合表达的植物表达载体PCAMBIA1304-IFN，利用根癌农 杆菌AGL-I介导的方法成功转化蛋白核小球藻，获得稳定遗传的小球藻转化体，并检测到 人工合成干扰素与绿色荧光蛋白融合基因在蛋白核小球藻转化细胞中成功表达。
[0009] 本发明一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包 括HuIFN-a2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-a2b基因序列进 优化改造，其所述方法包括：1)利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使 用频率低的密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN-a2b基因序列，并连 入PCAMBIA1304中，构建重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转化大肠杆菌；2)用大肠杆菌转 化子提取重组质粒PCAMBIA1304-IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆 菌AGL-I;3)利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的 T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN-a2b基因整合到小 球藻基因组中并表达。
[0010] 本发明所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其所述1)步合成相应 的小球藻表达的人干扰素HuIFN-a2b基因序列，方法如下：⑴用小球藻Rubisc蛋白对应 氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；(2)在优化的人干扰素HuIFN-a2b 基因5'端加A，使其形成AflIII限制性酶切位点，在其3'去掉终止密码子，添加SpeI的 限制性酶切位点；（3)将pCAMBIA1304通过NcoI(CICATGG)和SpeI(AICTAGT)双酶切， 人工合成人干扰素HuIFN-a2b基因用AfIIII(AICATGT)和SpeI(AICTAGT)双酶切，回收 酶切片段，T4DNA连接酶将粘性末端连接，制成重组质粒pCAMBIA1304-IFN表达载体。
[0011] 本发明所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，所述HuIFN-a2b基因 序列的设计引物为：
[0012] IFN-IFP :5' ATGTGCGACCTTCCCCAGAC3'
[0013]IFN-IRP :5' CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC3'
[0014] 其扩增产物长度为498bp;
[0015]IFN-2FP :5' ACAGGCACGACTTCGGCTTC3'
[0016]IFN-2RP ：5rCGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC3r
[0017] 其扩增产物长度为321bp。
[0018] 本发明所述的方法，所述人干扰素HuIFN-a 2b基因的合成按照优化后人干扰素 HuIFN-a 2b基因人工合成该序列，两端加AflIII和SpeI酶切位点，将pCAMBIA1304通 过NcoI和SpeI双酶切，人工合成序列构建AflIII和SpeI双酶切，连接两个片段构建 PCAMBIA1304-IFN表达载体。
[0019] 本发明所述小球藻优选为蛋白核小球藻。
[0020] 本发明是根据蛋白核小球藻对密码子的偏好性，设计并合成适合蛋白核 小球藻表达的HuIFN-a2b基因序列，并连入pCAMBIA1304,构建的重组质粒命名为 PCAMBIA1304-IFN，将其转化大肠杆菌，挑取若干大肠杆菌转化子提取重组质粒，经过PCR 和酶切鉴定，确认重组质粒PCAMBIA1304-IFN构建成功。将pCAMBIA1304-IFN转入根癌农 杆菌AGL-1，挑取若干农杆菌转化子进行PCR鉴定，确定其均为阳性转化子，可作为工程菌 转化小球藻。
[0021 ] 利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIAl304-IFN中的 T-DNA区整合入小球藻的基因组中，其中包括潮霉素抗性基因和HuIFN-a2b基因，潮霉素 抗性基因的表达使得转基因小球藻可以含潮霉素的选择培养基上生长，挑取3个选择培养 基上的藻落除菌，在无选择压的培养基中生长后，继续划线于含潮霉素的选择培养基上让 其生长，结果只有一个藻株拥有较稳定的潮霉素抗性。提取其基因组DNA和总RNA分别进 行PCR和RT-PCR鉴定，确定HuIFN-a2b基因已经成功整合入小球藻基因组DNA并且转录 成功。
[0022] 通过Western Blot检测融合蛋白的表达，由于融合蛋白的分子量大约为115KDa 左右，只要检测100_130KDa之间是否有特异条带即可确定融合蛋白的表达与否，最终显示 结果表明转基因小球藻显出特异条带而野生小球藻没有，通过荧光显微镜观察到部分转基 因小球藻发出绿色荧光而，确定优化改造并人工合成的HuIFN-a2b基因已经在小球藻细 胞中成功翻译表达。
【附图说明】：
[0023] 图1、人干扰素HuIFN-a2b基因密码子优化前后对比图，位于附图左边的是人干 扰素HuIFN-a2b基因优化前的密码子，右边的则是人干扰素HuIFN-a2b基因优化后的密 码子；
[0024] 图2、人干扰素此正^<1213基因人工合成该序列，连接两个片段？041^141304-正~ 表达载体构建过程图；
[0025] 图3、人干扰素肋正^€1213基因已经成功连入质粒？041^141304图，即重组质粒 IFN-2FP/IFN-2RPPCR扩增图；
[0026] 图4、根癌农杆菌提取质粒IFN-2FP/IFN-2RP扩增图；
[0027] 图5、转基因小球藻的RT-PCR鉴定图；
[0028] 图6、转基因小球藻干扰素融合蛋白的表达图。
[0029] 本发明的图3中的1-6表示泳道，图中的泳道1表示去离子水扩增结果，泳道2-5 : 重组质粒扩增结果，泳道6 :Maker ;
[0030] 本发明的图4中的1-8表示泳道，图中的泳道1表示去离子水扩增结果，泳道2-7 : 提取质粒扩增结果，泳道8 :Maker ;
[0031] 图5中的1-7表示泳道，图中的泳道1表示Maker，泳道2、4、6分别表示：转基因 的小球藻的cDNA、野生型小球藻的cDNA、pCAMBIA1304-IFN以及IFN-2FP/IFN-2RP引物 RT-PCR扩增的结果；泳道3、5、7分别表示：转基因的小球藻的cDNA、野生型小球藻的cDNA、 PCAMBIA1304-IFN以及IFN-1FP/IFN-1RP引物RT-PCR扩增的结果；
[0032] 图6中1-6表示泳道，图中的泳道1-3表示转基因小球藻，泳道4-6表示野生型小 球藻。
【具体实施方式】：
[0033] 通过下述实施例对本发明作进一步的详细说明，其将有助于进一步理解本发明技 术方案，但不限制本发明的内容。
[0034] 实施例：
[0035] 本发明所用材料与方法：
[0036] 蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidsa，FACHB-9)购自中科院的某生物研究所； 以下实施例中所示小球藻如无殊说明均是指蛋白核小球藻；
[0037] 根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens，AGL-1)为本单位实验室保存；
[0038]PCAMBIA1304购自长沙某生物技术有限公司；
[0039] 主要仪器设备：
[0040] 高速冷冻离心机、基因扩增仪、紫外可见光分光光度计、超低温冰