AGT)双酶切，人工合成 HuIFN-a2b基因AfIIII(AICATGT)和SpeI(AICTAGT)双酶切，回收酶切片段，T4DNA连 接酶将粘性末端连接，构建PCAMBIA1304-IFN表达载体。
[0089] 利用大肠杆菌DH5 a感受态的制备和热激法转化：
[0090] 1)将保存于_70°C超低温冰箱中的大肠杆菌DH5a菌种取出，在LB固体培养基上 划线，置于37°C倒置培养过夜；
[0091] 2)在长出菌落的LB固体平板上挑取单菌落至2mLLB液体培养基中，置于摇床，温 度设置37°C，转速设置220rpm，摇动培养过夜；
[0092] 3)将500yL菌液接种至50mLLB液体培养基中，按1 : 100比例，37°C、220rpm 摇床摇动培养至0D600~0. 5,控制时间约3h，培养两瓶；
[0093] 4)将菌液倒入灭菌的50mL离心管中，立即冰浴10~15min，直至菌液完全冷却；
[0094] 5)将离心管置于冷冻离心机中，温度设置4°C，转速设置5000rpm，离心lOmin，收 集菌体，倒出LB液体培养基，将离心管置于灭菌滤纸上倒置lmin，使残留的培养基流尽；
[0095] 6)用30mL预冷的0?lmol/LCaCl2-MgCl2溶液重悬菌体，置于冰上；
[0096] 7)将离心管置于冷冻离心机中，4°C，5000rpm，离心lOmin，倒出上清液，收集菌 体，将离心管置于灭菌滤纸上倒置lmin，使残留的溶液流尽；
[0097] 8)每个离心管加2mL预冷的0.lmol/LCaCl2溶液重悬菌体，然后加入860yL50 % 甘油，混匀，使甘油的最终浓度为15 % (V/V)，置于冰上；
[0098] 9)将上述菌液每50yL分装于预冷的I. 5mL灭菌离心管中，液氮速冻，置于-70°C 超低温冰箱中保存。
[0099]对大肠杆菌DH5 a的热激法转化：
[0100] 1)保存于-70°C超低温冰箱中的大肠杆菌DH5a感受态细胞取出，置于冰上融 化；
[0101] 2)加入IyL重组质粒混匀，置于冰上30min;
[0102] 3)将混有质粒的菌液置于42°C水浴中热激90s，然后迅速置于冰上冷却2min;
[0103] 4)加入700yLLB液体培养基，37°C、200rpm摇床摇动培养Ih;
[0104] 5)将离心管置于离心机中，5000rpm，离心lOmin，去除650yLLB液体培养基，然 后将菌体沉淀用枪轻轻吹打，使之重悬混匀；
[0105] 6)将上述菌液均匀涂布于含50mg/LKan的LB固体培养基上，置于37°C生化培养 箱中倒置培养过夜。
[0106] 大肠杆菌质粒的提取和鉴定：
[0107]1)挑取大肠杆菌转化子于3mL含50mg/LKan的LB液体培养基中，37°C，220rpm， 摇床摇动培养过夜，然后进行如下操作；
[0108] 2)在提取质粒之前，吸出500yL菌液到灭菌的I. 5mL离心管中，加入500yL50% 甘油混匀，编号，液氮速冻，超低温冰箱保存，然后将剩余2. 5mL菌液分次加入I. 5mL离心管 中，1200rpm离心lmin，尽量吸去上清；
[0109] 3)向离心管中加入IOOyL预冷的质粒提取溶液I，在旋涡振荡器上振荡，将沉淀 的菌体重悬，冰上放置5min;
[0110] 4)配制质粒提取溶液II，向离心管中加入200iiL，盖紧管盖，轻轻地上下颠倒混 匀4~6次，冰上放置5min;
[0111] 5)向离心管中加入150yL质粒提取溶液III，轻轻地上下颠倒混匀4~6次，此时 菌液变得粘稠且清亮，冰上放置5min;
[0112] 6)4°C，12000rpm，离心10min，将上清液吸出至一新的灭菌的I. 5mL离心管中（约 400yL，不可将沉淀吸出）；
[0113] 7)加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)，充分振荡混勾，12000rpm，离心IOmin;
[0114] 8)取上清液至一新的灭菌的I. 5mL离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaAc(PH5. 2)，加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀；
[0115] 9)放入-20°C冰箱静置至少 30min，然后 4°C，12000rpm，离心IOmin;
[0116] 10)弃去上清液，用75 %的乙醇洗涤两次，沉淀自然干燥，加入灭菌去离子水 (200yL中加IyL10mg/L的RNaseA);
[0117] 11)根据人干扰素HuIFN-a2b基因序列设计引物：
[0118] IFN-IFP :5' ATGTGCGACCTTCCCCAGAC3'
[0119] IFN-IRP :5' CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC3'
[0120]其扩增产物长度为498bp，
[0121] IFN-2FP-.5'ACAGGCACGACTTCGGCTTC3r
[0122] IFN-2RP ： 5rCGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC3r
[0123] 其扩增产物长度为321bp。
[0124] 质粒的PCR鉴定，PCR扩增体系（20yL)表I:
[0128] PCR扩增产物于2 %琼脂糖凝胶检测；
[0129] 12)质粒的酶切鉴定：由于NcoI与AflIII同尾酶连接后，不能被限制性内切酶识 另Ij，故利用HuIFN-a2b基因之前多克隆位点中HindIII限制性酶切位点与HuIFN-a2b基因 最后SpeI限制性酶切位点进行双酶切，切出的片段长度是1262bp。
[0130] 双酶切反应体系（10yL)表2 :
[0131]
[0132] 37°C酶切过夜，酶切产物于I. 2%琼脂糖凝胶检测。
[0133] 根癌农杆菌感受态细胞制备，冻融法：
[0134] 1)将保存于_70°C超低温冰箱中的农杆菌菌株取出，在LB固体培养基上划线，置 于28°C倒置培养1-2天，直至有菌落长出；
[0135] 2)挑取农杆菌单菌落于5mLLB液体培养基中，28°C，220rpm，摇床摇动培养36h;
[0136]3)将500yL农杆菌菌液接种至50mLLB液体培养基中（按1 : 100比例），28°C， 220rpm，摇床摇动培养至0D600~0? 5 (约6h)，培养两瓶；
[0137] 4)将菌液倒入灭菌的50mL离心管中，立即冰浴10~15min，直至菌液完全冷却；
[0138] 5)将离心管置于冷冻离心机中，4°C，5000rpm，离心lOmin，收集菌体，倒出LB液体 培养基，将离心管置于灭菌滤纸上倒置lmin，使残留的培养基流尽；
[0139] 6)将农杆菌重悬于IOmL 0. 15mol/LNaCl溶液中，冰上放置IOmin ;
[0140]7) 4°C，5000rpm，离心lOmin，倒出上清液，收集菌体，将离心管置于灭菌滤纸上倒 置Imin，使残留的溶液流尽；
[0141] 8)将农杆菌用ImL0. 02mol/LCaCU容液重悬，置于冰上，
[0142]9)将上述菌液每IOOyL分装于预冷的1.5mL灭菌离心管中，液氮速冻，置 于_70°C超低温冰箱中保存；
[0143] 根癌农杆菌冻融法转化：
[0144] 1)将保存于_70°C超低温冰箱中的农杆菌冻融法感受态细胞取出，置于冰上融 化；
[0145] 2)加入IyL重组质粒混匀，冰浴5min;
[0146] 3)放入液氮速冻5min，然后37°C水浴5min;
[0147] 4)加入ImLLB液体培养基，28°C，200rpm，摇床摇动培养2h;
[0148] 5)将离心管置于离心机中，5000rpm，离心lOmin，去除ImLLB液体培养基，然后将 菌体沉淀用枪轻轻吹打，使之重悬混匀；
[0149]6)将上述菌液均匀涂布于含50mg/LKan、50mg/LRif的LB固体培养基上，置于 28°C生化培养箱中倒置培养2天以上，至板上长出单菌落；
[0150] 根癌农杆菌质粒的提取和鉴定：
[0151] 1)挑取农杆菌转化子于5mL含50mg/LKan和50mg/LRif的LB液体培养基中， 28°C，220rpm，摇床摇动培养2天，然后利用康为世纪质粒小提试剂盒进行如下操作；
[0152]2)在提取质粒之前，吸出500yL菌液到灭菌的I. 5mL离心管中，加入500yL50% 甘油混匀，编号，液氮速冻，超低温冰箱保存，然后将剩余4. 5mL菌液分次加入I. 5mL离心管 中，1200rpm离心lmin，尽量吸去上清；
[0153] 3)向有农杆菌沉淀的离心管中加入250yLBufferPl(在使用前预先加好 RNaseA)，用漩涡混合器将细菌沉淀彻底重悬起来；
[0154] 4)向离心管中再加250yLBufferP2,轻轻地上下颠倒混勾4~6次，使菌体充分 裂解，此时菌液变得粘稠且清亮。此步操作时间不应超过5min，以防质粒受到破坏；
[0155] 5)向离心管中再加250yLBufferN3,立即轻轻地上下颠倒混匀4~6次，此时离 心管内会出现白色絮状沉淀，1200rpm离心lOmin，将沉淀离心至离心管底部；
[0156] 6)将已装入收集管的吸附柱中加入200yLBufferPS，12000rpm离心2min，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱重新装回收集管中；
[0157] 7)将步骤5所得的上清液加入已经装入收集管的吸附柱中，不可将沉淀吸出， 12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱装回收集管中；
[0158] 8)向收集管中加入600yLBufferPW，使用之前预先加入无水乙醇，12000rpm离 心lmin，倒掉收集管中的废液；
[0159] 9)重复步骤8;
[0160] 10)将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液。将吸 附柱置于室温下数分钟，将残留的乙醇挥发掉；
[0161] 11)将吸附柱置于一个新的灭菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50yLBufferEB(预先在65°C-70°C加热），室温放置数分钟，12000rpm离心Imin;
[0162] 12)将离心管中的质粒溶液重新加到吸附膜的中间部位，重复步骤11，然后收集 质粒溶液做鉴定，剩余的-20°C保存；
[0163] 13)农杆菌提取质粒的