HuIFN-a2b基因序列为人类基因序列，有些密码子在小球藻中使用频 率极低或不常使用，为了最大限度地提高在宿主小球藻中的基因表达效率，用小球藻的偏 好密码进行替换。找到小球藻使用频率低的密码子CTA、CAA、AGA、ATA、AAA、TTA ;Rubisc是 地球上最丰富的蛋白，是植物和小球藻中含量最多，表达量最高的蛋白之一；因此，用小球 藻Rubisc蛋白（核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶）对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低 的密码子替换掉，对比优化前后序列差异性如图1所示。
[0231] 人干扰素HuIFN-a2b基因的合成和表达载体的构建：
[0232] 按照优化后HuIFN-a2b基因人工合成该序列，两端加AfIIII和SpeI酶切位点， 将PCAMBIA1304通过NcoI和SpeI双酶切，人工合成序列构建AflIII和SpeI双酶切， 连接两个片段构建PCAMBIA1304-IFN表达载体，如图2所示，测序确定该载体构建正确。
[0233] 大肠杆菌的遗传转化、转化体的筛选和鉴定：
[0234] 挑取四个大肠杆菌转化子提取重组质粒，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/ IFN-2RP引物扩增，结果可以看到重组质粒可以扩增出498bp和321pb长的片段，可知这四 个大肠杆菌均为阳性转化子，而且HuIFN-a2b基因已经成功连入质粒pCAMBIA1304,如图3 所示；
[0235] 将大肠杆菌中提取的重组质粒进行HindIII和SpeI双酶切，可以看到经过酶切 后，出现一条介于1000 bp和2000bp之间的条带，靠近lOOObp，与重组质粒两个酶切位点之 间1262bp的距离一致，可知HuIFN-a2b基因已经连入质粒pCAMBIA1304对应的位点，重组 质粒连接正确；
[0236] 根癌农杆菌的遗传转化、转化体的筛选和鉴定：
[0237] 挑取六个农杆菌转化子提取质粒，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引 物扩增，结果可以看到扩增出498bp和321pb长的片段，可知这六个农杆菌均为阳性转化 子，可以作为转化小球藻的工程菌，如如图4所示；
[0238] 小球藻的遗传转化和转化体的筛选：
[0239] 将诱导培养后的农杆菌，含有PCAMBIA1304-IFN表达载体菌液与经过处理的对数 期小球藻藻液混匀，装入离心管中，25°C，黑暗共培养2天；2天后将共培养藻液均匀涂布于 选择培养基上，28°C，生化培养箱黑暗培养3天，然后光照培养，约2周后，选择培养基上长 出少量藻落，获得小球藻转化体，而对照组则没有藻落长出。
[0240] 小球藻转化体的PCR鉴定，所述小球藻为蛋白核小球藻：
[0241] 为了验证小球藻转化体的真实性，提取小球藻转化体和野生型小球藻的基因组 DNA，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引物扩增，结果转基因小球藻DNA可以扩 增出498bp和321pb长的片段，且与pCAMBIA1304-IFN质粒扩增出的片段长度相同，而野生 型的小球藻的DNA没有相应的条带扩增出来，可知HuIFN-a2b基因已经成功转入小球藻。
[0242] 小球藻转化体的RT-PCR鉴定：
[0243] 为了考察小球藻转化体中人干扰素基因在转录水平上的表达情况，提取转基因小 球藻和野生型小球藻的总RNA，逆转录合成cDNA，然后以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/ IFN-2RP引物扩增，结果转基因小球藻的cDNA可以扩增出498bp和321pb长的片段，与 PCAMBIA1304-IFN质粒扩增出的片段长度相同，而野生型小球藻的cDNA没有相应的条带扩 增出来，可知HuIFN-a2b基因已经在小球藻细胞内成功转录。
[0244] Western Blot检测转基因小球藻干扰素融合蛋白的表达：
[0245] 确定HuIFN-a2b基因已经转入小球藻并可以成功转录后，要进一步验证融合蛋 白的表达必须通过Westernblot，在融合蛋白的C端带有6个组氨酸组成的His-tag，利用 该标签可以提取以及鉴定融合蛋白；
[0246] 用提取缓冲液1提取转基因小球藻和野生型小球藻的总蛋白，WesternBlot检测 C端带有His-tag的融合蛋白，将100-130KDa之间的膜切下来，封闭，孵育一、二抗，然后显 色，转基因小球藻的膜上出现条带而野生型小球藻对应的位置没有相应的条带显现出来， 可知融合蛋白在转基因小球藻中表达，如图6所示；转基因小球藻融合蛋白观察：
[0247] 将转基因小球藻与未转基因的小球藻临时玻片在荧光显微镜下观察可看到转基 因小球藻细胞有一部分呈现绿色荧光，而野生型小球藻则基本全部呈现由叶绿体发出的红 色荧光，可见干扰素与绿色荧光蛋白的融合蛋白已经在小球藻细胞内成功表达，可能由于 遗传的不稳定、外源蛋白表达量的差异或者表达的时空差异，转基因小球藻也不是全部都 呈现绿色荧光；
[0248] 根据蛋白核小球藻对密码子的偏好性，设计并合成适合蛋白核小球藻表达的 HuIFN-a2b基因序列，并连入pCAMBIA1304,挑取4个大肠杆菌转化子提取重组质粒，经过 PCR和酶切鉴定，确认重组质粒pCAMBIA1304-IFN构建成功。将pCAMBIA1304-IFN转入根癌 农杆菌AGL-I，挑取6个农杆菌转化子进行PCR鉴定，确定其均为阳性转化子，可作为工程菌 转化小球藻。利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒PCAMBIA1304-IFN中的 T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，其中包括潮霉素抗性基因和HuIFN-a2b基因，潮霉 素抗性基因的表达使得转基因小球藻可以含潮霉素的选择培养基上生长，挑取3个选择培 养基上的藻落除菌，在无选择压的培养基中生长后，继续划线于含潮霉素的选择培养基上 让其生长，结果只有一个藻株拥有较稳定的潮霉素抗性。提取其基因组DNA和总RNA分别 进行PCR和RT-PCR鉴定，确定HuIFN-a2b基因已经成功整合入小球藻基因组DNA并且转 录成功；
[0249] 通过WesternBlot检测融合蛋白的表达，由于融合蛋白的分子量大约为115KDa 左右，只要检测100_130KDa之间是否有特异条带即可确定融合蛋白的表达与否，最终显示 结果表明转基因小球藻显出特异条带而野生小球藻没有，通过荧光显微镜观察到部分转基 因小球藻发出绿色荧光而，确定人干扰素HuIFN-a2b基因已经在小球藻细胞内成功翻译 表达。
【主权项】
1. 一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-a 2b 基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-a 2b基因序列进优化改造，其特征 是所述方法包括：1)利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的 密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN- a 2b基因序列，并连入pCAMBIA1304 中，构建重组质粒PCAMBIA1304-IFN，并转化大肠杆菌；2)用大肠杆菌转化子提取重组质粒 PCAMBIA1304-IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-I ;3)利用根癌 农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒PCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻 的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN-a 2b基因整合到小球藻基因组中并表达。2. 依据权利要求1所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征是所述 1)步合成相应的小球藻表达的人干扰素HuIFN-a 2b基因序列，方法如下：（1)用小球藻 R u b i s c蛋白对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；（2)在优化 的人干扰素HuIFN- a 2b基因5'端加A，使其形成Afl III限制性酶切位点，在其3'去掉 终止密码子，添加SpeI的限制性酶切位点；（3)将pCAMBIA1304通过NcoI (ClCATGG) 和SpeI (AlCTAGT)双酶切，人工合成人干扰素HuIFN-a 2b基因用AflIII(AlCATGT)和 SpeI (aIctagt)双酶切，回收酶切片段，T4 DNA连接酶将粘性末端连接，制成重组质粒 PCAMBIA1304-IFN 表达载体。3. 依据权利要求1或2所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征是所 述人干扰素HuIFN-a 2b基因序列的设计引物为： IFN-I FP^r ATGTGCGACCTTCCCCAGAC 3r IFN-I RP^r CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC 3r 其扩增产物长度为498 bp ; IFN-2 FP^r ACAGGCACGACTTCGGCTTC 3r IFN-2 RP^r CGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC 3r 其扩增产物长度为321 bp。4. 依据权利要求1或2所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征所述 人干扰素HuIFN- a 2b基因的合成按照优化后人干扰素你//W- a %基因人工合成该序列， 两端加J/7III和分e I酶切位点，将pCAMBIA1304通过Afco /和分e /双酶切，人工合成序 列构建J/7III和分e I双酶切，连接两个片段构建pCAMBIA1304-IFN表达载体。5. 依据权利要求1或2所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征所述 小球藻为蛋白核小球藻。
【专利摘要】本发明就是要提供一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其所述方法包括：1）利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，并转化大肠杆菌；2）用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转入根癌农杆菌AGL-1；3）？利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中并表达。用小球藻的偏好密码子对人干扰素（HuIFN-α2b）基因序列进行优化改造并人工合成该基因，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，获得稳定遗传的小球藻转化体，并检测到人工合成干扰素与绿色荧光蛋白融合基因在蛋白核小球藻转化细胞中成功表达。
【IPC分类】C12R1/89, C12N15/21, C12N15/79
【公开号】CN105087629
【申请号】CN201510597160
【发明人】卢其能, 周琨, 徐长豪, 李润根
【申请人】宜春学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月18日