箱、电泳仪、凝胶 成像系统、灭菌锅、分析天平、酸度计、光照培养箱、恒温振荡器、酶标仪、蛋白成像系统、电 转仪、荧光显微镜等；
[0041] 药品与试剂：
[0042]NaCl、NaOH、K2HPO4?3H20、KH2PO4'MgSO4?7H20、（NH4) 2S04、CaCl2?2H20、FeSO4?7H20、 MgCl2、NaAc、KAc、EDTA、CTAB、Tris、SDS、MES、Hindlll、SpeI、2XTaqPCRMasterMix、 DNAmaker、DNaseI、乙酰丁香酮、琼脂糖、琼脂粉、葡萄糖、尿素、乙醇、蛋白胨、酵母提取 物、RNAout试剂盒。聚乙烯吡咯烷酮（PVP40)、磺基水杨酸、NaN3、Na2S2O3、甲醛、异丙醇、冰 醋酸、三氯乙酸、甘油、丙烯酰胺、N，N' -亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸/过硫酸铵、丽春红S、考 马斯亮蓝、溴酚蓝、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白预染Maker、脱脂奶粉、Tween-20、ECL发 光液和NC膜、Anti-6XHis-Tagantibody、羊抗兔HRP标记；
[0043] 实验方法：
[0044] 试剂配制，
[0045]LB(LuriaBroth)培养基：10g蛋白胨（typtone)，5g酵母提取物（yeast extract)，IOgNaCl溶解于QSOmT,去离子水中，用lmol/LNaOH调节pH至 7. 0,10OOmT,容量 瓶定容，121°C，25min高压除菌，4°C保存；
[0046]LB固体培养基另加琼脂粉1. 5%，頂培养基即诱导培养基：将下述2种溶液混匀 配成工作液，4°C保存，
[0047]頂培养基I(900mL):NaCl0? 15g，K2HPO4 ? 3H20 2. 7g，KH2PO4I. 45g，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，（NH4)2SO4 0? 5g，加去离子水 800mL溶解，调PH至 5. 3,加水至 900mL，121°C，25min高 压除菌；
[0048]頂培养基II(IOOmL) :CaCl2 ? 2H20 0? 067g，FeSO4 ? 7H20 0? 0025g，C6H12O6 2g，MES 8. 54g，甘油0. 5g，调pH至5. 3,0. 22ym针头式过滤器过滤除菌；
[0049] 选择固体培养基：量取90mLBG-Il培养基，加入Ig琼脂粉，121°C，25min高压 除菌，待其温度降到 60°C左右，加入 10mL10XGlu+Urea、200yL100mg/mL的Amp200yL lOOmg/mL的Cef和200yL50mg/mL的Hyg，混匀，倒入培养皿，待其冷却凝固，封口膜密封， 4°C保存；
[0050] 0.lmol/LCaCl2溶液：称取CaCl2 ? 2H20I. 47g，溶于足量的去离子水，IOOmL容量 瓶定容，0. 22ym针头式过滤器过滤除菌；
[0051]CaCl2-MgCl2溶液（80mmol/LMgCl2、20mmol/LCaCl2):称取I. 63g，溶于足量的去 离子水中，加入0.lmol/LCaCl2溶液20mL，IOOmL容量瓶定容，0. 22ym针头式过滤器过滤 除囷；
[0052] 0?lmol/LCaCl2溶液：称取CaCl2?2H20I.47g，溶于足量的去离子水，IOOmL容量 瓶定容，0. 22ym针头式过滤器过滤除菌；
[0053] 50%甘油：量取50mL甘油，加入50mL去离子水，混匀，121°C，25min高压除菌，4°C 保存；
[0054]5mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl，加热溶解于足量的去离子水，IOOmL容量瓶 定容，121°C，25min高压除菌，室温保存；
[0055] 3mol/LNaAc(pH5. 2):称取NaAc24. 6g，溶于80mL去离子水中，加冰醋酸调PH至 5. 2,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高压除菌，室温保存；
[0056]lmol/LTirs-Hcl(pH8. 0):称取Tirs12. 114g，溶于 80mL去离子水中，加浓盐酸 调节pH至8. 0,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高压除菌，室温保存；
[0057] 5mol/LKAc(pH6. 0):称取KAc49. 07g，溶于80mL去离子水中，加冰醋酸调PH至 6. 0,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高压除菌，室温保存；
[0058] 10mol/L NaOH:称取40g NaOH，溶于80mL去离子水中，IOOmL容量瓶定容，室温保 存；
[0059] 0? 5mol/LEDTA(pH8. 0):称取EDTA-Na2 18. 16g，加 80mL去离子水，磁力搅拌器上 搅拌，慢慢加入l〇mol/LNaOH，调节PH至8. 0,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高压除菌， 室温保存；
[0060] 10%SDS:称取SDSlOg，加热溶解于足量去离子水中，IOOmL容量瓶定容，室温保 存；
[0061]质粒提取溶液I=C6H12O6?H20lg，lmol/LTirs-Hcl(pH8. 0)2. 5mL，0. 5mol/ LEDTA(pH8. 0) 2mL，IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高压除菌，4°C保存；
[0062]质粒提取溶液II:10%SDS100yL，lOmol/LNaOH20yL，灭菌去离子水 880yL 制成ImL质粒提取溶液II，现用现配；
[0063] 质粒提取溶液III:5mol/LKAc(PH6. 0) 60mL，冰乙酸11. 5mL，灭菌去离子水 28. 5mL，配好后装入一个灭菌的瓶子中，4°C保存；
[0064] 0. 15mol/LNaCl溶液：称取0. 877gNaCl，溶于足量的去离子水，IOOmL容量瓶定 容，121°C，25min高压除菌，4°C保存；
[0065] 0? 02mol/LCaCl2溶液：取灭菌的 15mL离心管，加入 0?lmol/LCaCl2溶液 2mL，再 加入8mL灭菌去离子水，混匀，4°C保存；
[0066]lOOmmol/LAS(乙酰丁香酮）：称取196. 2mg乙酰丁香酮，溶于5mLDMS0,加去离子 水定溶于10mL，超净台中操作，所有器具都需灭菌，-20°C保存；CTAB提取液：称取CTAB2g， 加入约 40mL去离子水中，加入lmol/LTirs-Hcl(PH8. 0) 10mL，0. 5mol/LEDTA(PH8. 0)4mL， 5mol/LNaCl溶液28mL，加热使CTAB溶解，IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高压除菌，室温 保存；
[0067]蛋白提取缓冲液I:10mmol/LTris-HCl(pH8. 0)加入 0? 020g/LNaN3以及 0.001g/LPMSF，
[0068]蛋白提取缓冲液2 :300mL去离子水中加入45mLlmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液、 75mL甘油和，6g聚乙烯吡咯烷酮（PVP40)以及0. 001g/LPMSF
[0069] 30% (W/V)丙稀酰胺溶液：29g丙稀酰胺（Acrylamide)和IgN,N' -亚甲双丙稀 酰胺溶于SOmL去离子水中，充分搅拌溶解，定容至100mL，0. 45ym膜过滤后置于棕色瓶中 4 °C保存待用；
[0070] 10% (W/V)过硫酸铵（AP) :0.Ig过硫酸铵溶于ImL去离子水中，4°C保存待用，有 效期为两周；
[0071] 10% (W/V)SDS=IOgSDS溶于80mL去离子水，加热溶解，定容至100mL，室温保存；
[0072]I. 5mol/LTris-HCl(pH8. 8) :18. 17gTris溶于 80mL去离子水中，加入浓盐酸调节 PH至8. 8,定容至100mL，4°C保存待用；
[0073]lmol/LTris-HCl(pH6. 8) :12.IgTris溶于 80mL去离子水中，加入浓盐酸调节PH 至6. 8,定容至100mL，4°C保存待用；
[0074] 5XTris-Glycinebuffer: 15.lgTris，94g甘氨酸，5gSDS，溶于HOOmT,去离子水 中，加热并充分搅拌使其溶解，定容至lOOOmL，室温保存；
[0075] 5XSDS-PAGELoadingbuffer:取 1.25mLlmol/LTris-HCl(pH6. 8)，0.5gSDS， 25mg溴酚蓝，2. 5mL甘油，加去离子水溶解并定容至5mL，0. 5mL/份分装，室温保存，使用前 每份加入25yLP-巯基乙醇；
[0076] 考马斯亮蓝R-250染液：称取Ig考马斯亮蓝R-250,加入250mL异丙醇，搅拌溶解， 加入IOOmL冰醋酸和650mL去离子水，充分搅拌，室温保存；
[0077] 考染脱色液：冰醋酸100mL，乙醇50mL，去离子水850mL，充分搅拌后，室温保存；
[0078] 甲酸固定液：40%甲醇、0? 5mL37%甲酸，
[0079]硫代硫酸盐显影液：3%Na2C03、0. 0004%Na2S203、0. 5mL/L37%福尔马林，
[0080] 半干式电转缓冲液：48mmol/LTris，39mmol/L甘氛酸（Glycine)，0? 04 %SDS， 20%甲醇；
[0081] 10X丽春红染液：丽春红S2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，去离子水定容至 IOOmL，室温保存；
[0082]TBST:lmol/LTris-HCl(pH7. 5) 10mL，加入 800mL去离子水，加入 8. 8gNaCl，加热 搅拌溶解，定容至1000ml，最后加入使用前加入20 %TWeen20，TWeen20的终浓度为0? 05 %〇 [0083] 本发明的基因序列的优化设计和表达载体的构建步骤为：
[0084] 1)先确定HuIFN-a2b基因序列；
[0085] 2)通过对HuIFN-a2b基因在普通小球藻中的密码子使用频率做一个分析，找出 小球藻使用频率低的密码子；
[0086]3)根据小球藻Rubisc蛋白，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，对应氨基酸的密码子将 小球藻使用频率低的密码子替换掉；
[0087] 4)在优化的人干扰素HuIFN-a2b基因5'端加A，使其形成AfIIII限制性酶切位 点，在其3'去掉终止密码子，添加SpeI的限制性酶切位点；
[0088] 5)将pCAMBIA1304 通过NcoI(ClCATGG)和SpeI(AlCT