成）为模板进行PCR，扩增得到目的片段UMcsh5基因的启动子序列UMPR0,并利用琼 脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，获得两端含有BgIII和SacI酶切位点目的产物约1500bp。
[0045] 1. 4荧光素酶报告基因（LUC)的获取
[0046] 应用primerprimer5. 0引物设计软件，设计焚光素酶报告基因（LUC)的扩增引物 LUC-F和LUC-R，以pGL4. 17 (购置于promega公司）为模板进行PCR，扩增得到目的片段约 1780bp荧光素酶报告基因（LUC)，并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；
[0047] 1. 5携带荧光素酶报告基因的重组质粒的构建
[0048] 将1. 3中获得的启动子序列UMPRO经BgIII与SacI双酶切处理后，纯化回收，并 将其与1. 2中获得的改组载体Ppic9kG进行连接，连接反应液转化入大肠杆菌DH5a感受 态（购置于北京全式金生物技术有限公司）中，在LB固体培养基上，37°C倒置培养16~ 20h，挑取氨苄青霉素抗性阳性单克隆，提取质粒DNA，利用菌落PCR、酶切等技术初步鉴定 阳性克隆，获得重组质粒，命名为PpiC9KG-UMPR0 ;随后，将提取的重组质粒PpiC9KG-UMPR0 与1. 4中获得的LUC基因经SnaBI和NotI双酶切后连接，将连接液转入大肠杆菌DH5a 感受态中，在固体培养基上，37°C倒置培养16~20h，挑取氨苄青霉素抗性阳性单克隆， 提取质粒DNA。利用菌落PCR、酶切等技术初步鉴定阳性克隆，获得重组质粒，命名为 Ppic9kG-UMPR0-LUC。重组质粒的构建见图1.
[0049]《实施例2》稳定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株GS115-UMPR0-LUC的筛选。
[0050] 2. 1毕赤酵母GSl 15电转化
[0051] 2.I. 1在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30°C过夜；
[0052] 2.I. 2取0. 1-0. 5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至 0D600 = 1. 3-1. 5 ；
[0053]2.L3在4°C，1500离心5min收集细胞，500ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
[0054] 2. 1. 4如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
[0055] 2. 1. 5如上离心，用20ml预冷的IM山梨醇悬浮细胞；
[0056] 2. 1. 6如上离心，用Iml预冷的IM山梨醇悬浮细胞，至终体积约I. 5ml;
[0057] 2.L7取80ul上述细胞与5~20ug线性化DNA(溶于5~IOulTE)混合，转入预 冷的0. 2cm电转杯中；
[0058] 2. 1. 8 在冰上放置 5min;
[0059] 2. 1. 9根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行点击；
[0060] 2.1. 10立即加入Iml预冷的IM山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
[0061] 2.I. 11分成200~600ul等份，涂于MD培养基（购置于青岛拓扑生物工程有限公 司）平板上；
[0062] 2. 1. 12在30°C孵育平板至克隆产生。
[0063] 2. 2稳定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株GS115-UMPR0-LUC的筛选
[0064] 挑取2. 1中的单菌落到含不同遗传霉素浓度的YPD-遗传霉素平板上，30°C孵 育3-4天，筛选遗传霉素抗性克隆。将遗传霉素抗性单克隆转接于96孔板中，每孔加 入200ulYro培养基，培养48小时后，4000rpm离心处理30min，之后取上清IOOul转移至 新的96孔板中，避光加入荧光素酶测试试剂（LARII)，用双荧光素酶报告基因检测系统 (Dwal-Lucif_sse:⑩：RepoterAssaySystem，Promega)检测，记录萤火虫焚光素酶读数。取 出96孔白板，避光加入50ul/孔Stop&Glo试剂，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活海肾 荧光素酶反应，记录海肾荧光素酶读数。用萤火虫荧光素酶读数除以海肾荧光素酶读数， 取平均值，求标准误差，以未转入重组质粒的GS115和空白培养基分别为阴性与空白对照。 GS115-UMPR0-LUC单克隆细胞株荧光素表达强度的检测结果见图2。重复三次试验，获得稳 定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株。
[0065]《实施例3》药物筛选的应用
[0066] 将单克隆细胞株GSl15-UMPR0-LUC按照每孔2XIO4个细胞铺于96孔板，加入候选 化合物Fl-FlO(50ug/ml)(选自实验室构建的化合物库），以不加候选化合物与YH)培养基 分别作为阳性和空白对照，每组实验设置三个复孔，作用48小时后，4000rpm离心30min，吸 取上清IOOul转移至新的96孔板中，加入焚光素酶底物（Bright_Glo?LuciferaseAssay System) 50ul/孔，静置Imin后进行检测。结果显示，加入化合物F7 (磷酸二酯类衍生物） 后，GS115-UMPR0-LUC细胞株产生荧光最弱，表明F7对UMPRO启动子活性抑制作用最强，见 图3。
[0067]
【主权项】
1. 一种靶向真菌细胞壁的几丁质合成酶下调剂高通量筛选模型，其特征是，所述 模型由几丁质合成酶UMcsh5基因启动子序列UMPRO、携带荧光素酶报告基因重组质粒 Ppic9KG-UMPR0-LUC、稳定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株GS115-UMPR0-LUC、筛选试剂 以及荧光素酶报告基因检测系统构成。2. 权利要求1所述的筛选模型，其特征是，几丁质合成酶选自真菌细胞周期开始时，在 细胞出芽位点处合成几丁质环的CS3 ( IV类）。3. 权利要求1所述的筛选模型，其特征是，几丁质合成酶UMcsh5基因启动子序列 UMPRO为SEQ ID No 1所示的DNA序列。4. 构建权利要求1所述筛选模型的方法，其特征是，将Ppic9k载体经BgI II与SacI 双酶切处理获得改组载体Ppic9KG ;根据NCBI Genbank NC_026483UMcsh5基因启动子区序 列设计引物，以人工合成的启动子序列UMPRO为模板进行PCR，将Ppic9KG与UMPRO相连，获 得重组质粒Ppic9KG-UMPR0 ;再应用primer primer5. 0引物设计软件，设计焚光素酶报告 基因的引物，以PGL4. 17模板进行PCR，获得荧光素酶报告基因，经SnaBI和NotI双酶切与 重组质粒Ppic9KG-UMPR0相连，获得重组质粒Ppic9KG-UMPR0-LUC ;将重组质粒电转入毕赤 酵母细胞GS115中，经不含组氨酸的筛选培养基和含遗传霉素的培养基双筛选，根据荧光 素酶报告基因检测结果，获取表达强度最高的单克隆细胞株GS115-UMPR0-LUC。5. 权利要求1所述模型在真菌细胞壁几丁质合成酶下调剂高通量筛选中的应用，其特 征是，所述应用是在GS115-UMPR0-LUC单克隆细胞株培养过程中，加入候选化合物，作用24 小时后，利用并根据荧光素酶报告基因检测荧光强度，反应启动子UMPRO的活性，进而筛选 对几丁质合成酶有抑制作用的候选药物。6. 权利要求5所述的应用，其特征是，所述候选化合物选自天然化合物、合成化合物、 有机小分子、无机小分子、糖类、脂类中的一种或几种。
【专利摘要】本发明涉及一种靶向真菌细胞壁的几丁质合成酶下调剂高通量筛选模型，属于基因工程领域，所述模型是由UMcsh5基因启动子序列UMPRO，携带荧光素酶报告基因的重组质粒Ppic9KG-UMPRO-LUC、稳定表达UMPRO启动子的单克隆细胞株GS115-UMPRO-LUC、筛选试剂以及荧光素酶报告基因检测系统构成，它具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、应用范围广和筛选效率高等优点，极具应用潜能。
【IPC分类】C12N15/65, C12Q1/68, C12N15/80, C12N1/19, C12Q1/02, C12R1/84
【公开号】CN105087630
【申请号】CN201510543219
【发明人】杨兆勇, 张晓琳, 赵晨, 李亚东, 金媛媛, 白利平, 黄颖, 冯晓洲, 汪康游, 樊帅
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月28日