专利名称：辐射诱发基因组不稳定性的检测方法
技术领域：
本发明涉及基因组的检测方法技术领域，特别是涉及辐射诱发基因组不稳定性的
检测方法。
背景技术：
基因组不稳定性是指基因组处于一种损伤易感态，它可以放大与累积其它损伤的
发生，最终的遗传改变体现在细胞照射后许多代仍然持续存在的基因组损伤，而受照细胞
本身并不是以某种特定的畸变形式出现。因此利用一些常规实验手段(如克隆存活率、单
细胞凝胶电泳SCGE以及微核发生率等)很难直接来验证基因组不稳定性，因为只有当损伤
累计到足够多的情况下才能利用一些常规实验手段检测到基因组不稳定性的发生。 基因组不稳定性是目前研究的热门课题，特别是人们认识到基因组不稳定性可能
是多级致癌理论中至关重要的一步，因此对基因组不稳定性的检测成为重要的研究方法，
但现有技术存在上述的缺点，因此特别需要借助其他方法来放大基因组不稳定性的效应，
以便于我们在常规实验条件下对其进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辐射诱发基因组不稳定性的检测方法，通过该检测方法能够在常规的实验条件下检测到基因组不稳定性，并且周期短，操作简便，可以更方便快捷地进行基因组不稳定性的检测。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案 辐射诱发基因组不稳定性的检测方法，包括以下步骤 (1)取对数生长期的CHL细胞消化后，在冰浴条件下进行6°Co Y射线照射，照射时分别采用不同的照射剂量，然后对照射后各个剂量点的CHL细胞立即进行克隆形成率、单细胞凝胶电泳、微核形成率的测定； (2)对受照后存活的各剂量点的细胞传25代后，进行单细胞凝胶电泳、微核发生率和染色体畸变率的检测； (3)对受照后存活的各剂量点的第26代或者以后的传代细胞，在与步骤(1)中相同的条件下再次用6°Co Y射线照射，照射剂量均为^ 2Gy，照射后立即进行克隆形成率、单细胞凝胶电泳、微核形成率的测定。 进一步，为使本发明获得更好的发明效果，步骤(1)中，照射时采用3-6个剂量点进行照射，每个剂量点的照射剂量分别为《10Gy ; 进一步，为使本发明获得更好的发明效果，步骤(3)中，对受照后存活的各剂量点的第26代或者以后的传代细胞进行照射时，照射剂量为2Gy ; 进一步，为使本发明获得更好的发明效果，步骤(3)中，对受照后存活的各剂量点的第33代或者以后的传代细胞进行照射。 本发明的效果在于，采用本发明所述的方法，具有如下优点利用二次照射手段模拟体内可能出现的二次事件，并且扩大了细胞的损伤终点效应，从而可以对多次传代后较难以测定的延迟损伤与延迟突变进行检测，这样不仅克服了传统的直接检测所需观察时间长的缺点，而且也克服了由于发生率太低难以在常规实验条件观察到基因组不稳定性的缺点，实现了在常规实验条件下对辐射诱发基因组不稳定性的检测。
图1是6°Co- Y射线照射后CHL细胞的克隆存活率示意图； 图2是6°Co- Y射线照射后CHL细胞的SCGE检测结果示意图； 图3是6°Co- Y射线照射后CHL细胞的微核发生率示意图； 图4是一次照射的CHL细胞经传25代后的SCGE检测结果示意图； 图5是一次照射的CHL细胞传25代后的微核发生率示意图； 图6是培养33代的细胞子代经2Gy 二次照射后的SCGE检测结果示意图； 图7是培养33代的细胞子代经2Gy 二次照射后的微核发生率示意图。
具体实施例方式
(1)取对数生长期的CHL细胞消化后，在冰浴条件下进行6°Co Y射线照射，具体到本实施例中，将对数生长期的CHL细胞消化后按IX 105的细胞浓度分别接种于6个25ml培养瓶中，放至于冰上，然后进行照射，照射剂量分别为0、2、4、6、8、10Gy，然后对照射后各个剂量点的CHL细胞立即进行克隆形成率、SCGE、微核形成率的测定，测定结果见图l-图3，该结果表明从细胞存活率曲线可以看出随着照射剂量的增大，细胞存活率明显降低；随着照射剂量的增大，细胞SCGE尾长增长，且二者存在明显的剂量_效应关系，其剂量_效应关系符合方程Y = 2. 081+0. 297X，相关系数r = 0. 992， P < 0. 0001。微核的发生率同受照剂量之间存在一定的剂量_效应关系，其剂量_效应关系符合方程Y =1. 986+1. 071X+0. 180X2，相关系数r = 0. 983， P < 0. 0001 。 事实上，通过该步骤的处理，实现了^Go Y射线照射CHL细胞后直接损伤效应的检测，通过实验数据即可以观察到照射后CHL细胞的直接损伤效应； (2)受照后存活的各剂量点的细胞传25代后，进行单细胞凝胶电泳(SCGE)、微核发生率和染色体畸变率的检测，测定结果见图4-图5，该结果表明一次照射的CHL细胞经传25代后各剂量点细胞的SCGE彗星尾长已无明显差异；各剂量组的微核发生率相差也很小，基本恢复正常。从该实验结果可以看出，受照后存活细胞对诱发的DNA损伤具有良好的修复作用，在细胞传代至25代后，各剂量点的细胞间无明显差异，成活率趋于一致；
(3)对受照后存活的各剂量点的第33代传代细胞，在与步骤(1)中相同的条件(即相同的细胞浓度和冰浴条件)下再次用6°CoY射线照射2Gy，该照射使细胞形成二次损伤，立即进行克隆形成率、微核形成率与SCGE的检测，实际上也就是对CHL细胞滞后效应的间接测定，测定结果见图6-图7，该结果表明二次损伤后的效应与第一次照射剂量明显相关，显示各剂量点间克隆形成能力总体存在下降趋势；而SCGE结果明确显示照射后所存在的滞后效应随着初始照射剂量的增大而增大。同时微核发生率显著升高，与第一次受照剂量呈线性相关关系。 从该测定结果可以看出二次照射使得基因组不稳定性表现出了明显的扩大效
4应，滞后损伤程度与初始受照剂量之间存在良好的剂量效应关系，从而证实了^Co Y射线在CHL细胞中能够诱发基因组不稳定性。 上述的检测结果表明细胞在接受射线照射后，细胞的生存率会随所受剂量的大小、DNA损伤程度的不同表现出不同的生存能力，但传代至25代后，各剂量组的细胞间无明显差异，成活率趋于一致。此时，受照后各剂量点存活细胞的子代在统一给予二次照射后，SCGE结果与微核发生率结果均表明，滞后损伤程度与初始受照剂量之间存在良好的剂量效应关系，从而证实了 6°Co Y射线在CHL细胞中能够诱发基因组不稳定性。
本发明所述检测方法的意义在于利用二次照射方法为在常规实验条件观察基因组不稳定性提供了一个较好的研究手段。由于基因组不稳定性可能是多级致癌理论中至关重要的一步，因此，对它的不断深入研究将为揭示细胞凋亡和癌症形成起到重要的作用，进而更好地为健康风险评价及辐射防护工作服务。 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
权利要求
辐射诱发基因组不稳定性的检测方法，包括以下步骤(1)取对数生长期的CHL细胞消化后，在冰浴条件下进行60Coγ射线照射，照射时分别采用不同的照射剂量，然后对照射后各个剂量点的CHL细胞立即进行克隆形成率、单细胞凝胶电泳、微核形成率的测定；(2)对受照后存活的各剂量点的细胞传25代后，进行单细胞凝胶电泳、微核发生率和染色体畸变率的检测；(3)对受照后存活的各剂量点的第26代或者以后的传代细胞，在与步骤(1)中相同的条件下再次用60Coγ射线照射，照射剂量均为≥2Gy，照射后立即进行克隆形成率、单细胞凝胶电泳、微核形成率的测定。
2. 根据权利要求l所述的辐射诱发基因组不稳定性的检测方法，其特征在于步骤(1)中，照射时采用3-6个剂量点进行照射，每个剂量点的照射剂量分别为《10Gy。
3. 根据权利要求l所述的辐射诱发基因组不稳定性的检测方法，其特征在于步骤(3)中，对受照后存活的各剂量点的第26代或者以后的传代细胞进行照射时，照射剂量为2Gy。
4. 根据权利要求l所述的辐射诱发基因组不稳定性的检测方法，其特征在于步骤(3)中，对受照后存活的各剂量点的第33代或者以后的传代细胞进行照射。
全文摘要
本发明涉及基因组的检测方法，特别是涉及辐射诱发基因组不稳定性的检测方法。本发明所述的检测方法，先给予细胞首次照射，并测定其SCGE与微核发生率，然后对受照后存活的各剂量点的细胞传25代后，测定SCGE与微核发生率，然后对受照后存活的各剂量点的第26或以后的传代细胞进行二次照射，再次测定SCGE结果与微核发生率，通过比较SCGE与微核发生率，即可明显看出二次照射可以诱发基因组不稳定性，细胞表现出明显的扩大损伤效应。采用本发明所述的方法，可以直接检测到基因组不稳定性，克服了传统的直接检测所需观察时间长和发生率太低难以在常规实验条件观察到基因组不稳定性的缺点。
文档编号C12Q1/02GK101748203SQ20081022799
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者左雅慧, 王仲文, 王小莉, 王放 申请人:中国辐射防护研究院