专利名称：谷氨酸脱羧酶热稳定变体g311p基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶变体G311P基因及其用途。
背景技术：
定点突变(site-directed mutagenesis 或 site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的有力工具，也是在实验室中改造基因的常用手段。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。特别是在酶的理性设计中，或利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有潜力的重要氨基酸位点后，进行定点突变分析，将有利于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用。
谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase,简称 GAD ；EC4.1.1. 15)是一种广泛地存在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的α -羧基脱羧反应生成Y-氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,简称GABA)。GABA是哺乳动物神经系统的一种关键的神经递质抑制剂，具有抑制中枢神经系统过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。由于身心紧张会导致人体血压升高、免疫功能失调、代谢紊乱，因此GABA对人体具有镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压，改善免疫功能，延缓衰老等作用，是一种在食品和医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家卫生部批准为“新资源食品”。目前，利用谷氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的生物制备正得到越来越多的重视。
作为生物技术富集生产GABA的关键酶，细菌GAD的热稳定性一直是限制其在大规模生物反应器中应用的因素之一。细菌GAD的最适温度一般在30 50°C之间，然而在60°C 以上酶的活力下降较快。而在工业生产过程中，往往希望采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度、降低体系粘度，从而提高生物催化与转化的效率。
中国专利申请200510049189. 4和中国专利申请200510049187. 5公开了一种生产 Y-氛基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306,对该菌株的GAD基因进行克隆，构建重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，可实现可溶表达。但是，该基因表达的GAD在60°C及以上的环境中很快失活，不利于该酶在GABA生物制备中的应用。发明内容
本发明所解决的技术 问题首先是提供一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其编码对应的变体酶在60°C和70°C下的热稳定性有明显提高，从而在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
本发明进一步的目的是提供上述变体基因编码的谷氨酸脱羧酶或包含上述变体基因的表达单元、重组质粒、或转化子。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是
一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G31IP基因，其核苷酸序列在第311位有定点突变。 研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306中的GAD基因。其中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306 已在中国专利申请 200510049189. 4 和中国专利申请200510049187. 5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微生物保藏管理中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院)。本申请使用的是浙江大学馈赠的。
经研究发现，短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC NO. 1306 中的 GAD 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，本申请将该基因第311位甘氨酸(Gly)的密码子GGT突变为脯氨酸(Pro)的密码子CCC，序列长度没有变化。得到的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种由上述谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因编码的谷氨酸脱羧酶。其氨基酸序列优选如SEQ ID NO. 2所示。
一种包含上述谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、重组质粒或转化子。表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞(如BL21(DE3))中实现胞内可溶表达。
本发明通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在 60°C和70°C下的热稳定性。本发明特异性选择对编码GAD第311位氨基酸残基位点的密码子进行替换，且采用编码脯氨酸的密码子替换编码谷氨酸的密码子、使GAD的第311位氨基酸残基由野生型的谷氨酸突变为脯氨酸，是因为采用分子设计方法对GAD上各氨基酸残基对GAD热稳定性的影响进行了分析，发现第311位氨基酸残基位点是一个对GAD的热稳定性有重要影响的氨基酸。基于氨基酸性质与蛋白质结构和性质间的关系，研究发现在该位点采用脯氨酸替换甘氨酸可以增加GAD蛋白质结构的刚性、提高GAD对热的稳定性。因此， 设计了引物，并通过定点突变方法构建了谷氨酸脱羧酶的热稳定突变体G311P。随着谷氨酸脱羧酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
图1为质粒pET28a(+)_gad的基因图谱；
图2为突变位点Gly311在GAD三级结构中的位置图(以球表示)；
图3为定点 突变原理示意图4为野生型GAD酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱；
图5为突变酶和野生型GAD在60°C的热稳定性；
图6为突变酶和野生型GAD在70°C的热稳定性。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明
一、构建重组质粒
将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306培养至对数生长中期，取4. 5mL菌液10000rpm离心一分钟后弃去上清，利用试剂盒(上海生工)按说明书提取基因组 DNA。
设计如下简并引物上游简并引物5'-cgggatccatggcffatgttRtaYggffaaac-31 (如 SEQ ID NO. 5 所示)；
下游简并引物5'-gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3;(如 SEQ ID NO. 6 所示)；
其中，上游引物中的“ggatcc”为BamH I酶切位点，下游引物中的“gaattc”为EcoR I酶切位点。
分别用上游引物和下游引物配对，选择和优化不同的模板/Pfu/引物比例，退火温度，循环次数，以所得基因组DNA为模板进行PCR，以得到扩展片段大小合适、丰度合适和非特异条带少的PCR结果，最终通过条件的优化，得到了一个长度约为1400bp的DNA条带。
所确定的PCR 体系组成为ddH20,38. 5 μ L ； 10 X Pfu buffer，5 μ L ;上游引物 O. 5 μ L ;下游引物，O. 5 μ L ；dNTP,4y L ;模板 DNA, I μ L ；Pfu,0. 5 μ L ;反应总体积为 50 μ L。
所用的PCR条件为94°C变性5min后进入扩增循环，即94°C变性1. 5min, 57°C退火lmin，72°C延伸3. 5min，共循环32次，最后再72°C延伸8min。扩增产物经凝胶电泳检验， 结果如图4所示，产物条带单一、清晰、明亮，大小在1400bp左右。将克隆产物测序，发现谷氨酸脱羧酶基因的保守序列。
用BamH I和EcoR I对扩增得到的目的基因和pET28a(+)进行双酶切，酶切条件如下DNA 20 μ L、10X K buffer 4 μ L、BamH I 4 μ L、EcoR I 4 μ L、ddH20 8 μ L，酶切温度为 35。。。
质粒酶切lh，PCR产物酶切4h。分别对酶切产物进行电泳纯化和切胶回收，电泳验证回收产物，然后进行连接，连接条件为=IOXbuffer 2 μ L、gad 10 μ L、质粒I μ L、 PEG30006 μ L、Τ4连接酶I μ L，连接温度为16°C，连接16小时。
连接反应结束后60°C保温5min灭活连接酶，再分别取连接产物转化E. coli DH5 α感受态细胞(氯化钙法)。转化产物涂布于含有终浓度为30 μ g/mL卡那霉素的LB固定培养基，37°C培养18小时后挑出阳性克隆，分别在含有30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养阳性克隆，提取质粒后进行BamH I和EcoR I双酶切、PCR验证，转化子含重组质粒 pET28a(+)_gad(如图1 所示)。经测序，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306中GAD基因如SEQ ID NO. 3所示，编码的GAD氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
二、野生型GAD的表达和纯化
取构建的表达谷氨酸脱羧酶的质粒pET28a(+)_gad转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，得到表达短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的重组工程菌。挑取菌体在含有终浓度为30 μ g/ mL卡那霉素的LB固体培养基平板上于37°C活化10小时，然后挑取单菌落接种20mL含有 30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、200rpm摇床培养过夜后，按2%的接种量接种于IOOmL含有30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中在37°C、200rpm摇床培养2 3 小时。当发酵液中菌体浓度(0D_)达到O. 6 O. 8时，向培养液中加入终浓度为1. Ommol/ L的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，改变培养温度到30°C，继续培养6 8小时。培养结束后,在4°C、8000Xg的条件下离心IOmin收集菌体。
然后采用破胞缓冲液重悬细胞，然后用N1-NTA(QIAGEN)进行金属螯合层析，得到野生型GAD纯酶，其操作步骤和所用试剂如“突变酶的表达与纯化”。
三、定点突变PCR产物的获得
向200 μ L的Eppendorf管中加入200 μ mo I的dNTPs,上、下游引物各I μ mo I,约 10ngpET28a(+)-gad 重组质粒作为模板 DNA，5yL 的 IOXPfu Buffer，2. 5U 的 Pfu DNA 聚合酶，然后加无菌蒸馏水至总体积为50 μ L。反应参数是在95°C预变性5min后，95°C变性 lmin,53°C退火2min,72°C延伸14min,经过18个循环,最后72°C延伸lOmin。
上游引物5’-CTTGGGTCCCGAACTACCTACGATGGCC-3> (如 SEQ ID NO. 7 所示);
下游引物5’-GTAGTTCGGGACCCAAGTAGCTGACCT-3，(如 SEQ ID NO. 8 所示);
其中，下划线标记的核酸序列组合为编码GAD第311位氨基酸残基的密码子。野生型GAD基因在该位置处的密码子为编码甘氨酸的密码子GGT ;在所设计的引物中，该位置的密码子替换为编码脯氨酸的密码子CCC。采用这对引物，根据定点突变原理，可以特异地在所扩增获得的GAD基因中引入密码子替换、使所得基因编码的GAD的第311位氨基酸残基变为脯氨酸，而不再是野生型的甘氨酸。定点突变的原理如图3所示。
四、定点突变PCR产物的转化与验证
将上述获得的定点突变PCR产物用Dpn I酶进行消化，以降解野生型质粒，消除转化子中野生型个体出现的可能。消化的体系为PCR产物10 μ L，IOXbuffer 2 μ L，Dpn I I μ L，加ddH20至总体积为20 μ L。
将消化以后的产物用CaCl2法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，具体操作如下
(I)从_70°C冰箱中取100 μ L的感受态细胞悬液，冰上融化；
(2)加入定点突变PCR消化产物5 μ L，轻轻混匀，冰上放置30min ；
(3)于42°C水浴热激110s，然后立即冰上放置2min ；
(4)向管中加入900 μ LSOC培养基，混匀，37°C振荡培养lh，使细胞复苏；
(5)将上述菌液摇匀，取适量涂布在含有30 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，正面向上放置半小时，待菌液被培养基吸收后倒置平板，37°C培养过夜。
待转化子长出后，随机挑选若干个克隆，提取质粒，进行全自动DNA测序，证实突变位点为Gly311 — Pro (如图2所示)。
五、突变酶的表达与纯化
将转化子接种到20mL含有30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C，180rpm 振荡过夜培养，然后以I %的接种量接种到含有30 μ g/mL卡那霉素的IOOmL LB液体培养基中，37°C，180rpm 培养至 OD600 为 O. 6 O. 8 时，加入 IPTG (终浓度为 O. 5mM), 30°C, 150rpm 继续诱导8h。诱导结束后,4<€下5000\8离心10111；[11,收集菌体沉淀。用pH 8. O磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液， ImMPMSF, 300mM NaCl，IOmM咪唑，pH 8.0)重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(300W，工作 3s，间隙6s)，15000Xg离心IOmin收集上清，即得到含有GAD的粗酶液。
采用N1-NTA亲和层析对上步所得的粗酶液进行分离纯化。经上样(loading)、清洗(washing)和洗脱(eluting)，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。
所用缓冲液配制如下
裂解缓冲液(disruption buffer) :50mM磷酸二氢钠，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF), 300mMNaCl, IOmM 咪唑，pH 8. O。
洗柱缓冲液(wash buffer) 50mM磷酸二氢钠，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF), 300mMNaCl,20mM 咪唑，pH 8. O。
洗脱缓冲液(elution buffer) :50mM磷酸二氢钠，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF), 300mMNaCl,250mM 咪唑，pH 8. O。
六、突变酶的热稳定性考察
将得到的G311P纯酶分别在60°C和70°C的情况下保温0，10，30，60，90min后，冰浴lOmin。取10 μ L纯酶，加入于48°C预热的200 μ L底物溶液(pH 4. 8，O.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，含O. OlmM PLP，50mM底物L-MSG)，迅速混匀后在48°C反应lOmin，反应结束后迅速放入沸水浴中IOmin以终止反应,离心,收集上清液,采用高效液相色谱法测定反应生成的GABA的量，以测定突变酶G311P的残余酶活力。在同样条件下，以野生型GAD的反应作为对照。HPLC操作条件如下色谱分离柱为Hypersil 0DS2C18 (250mmX4. 6mm)(大连依利特公司)，紫外检测波长为254nm，进样量为10 μ L，控制柱温25°C，流动相A为甲醇， 流动相B为四氢呋喃甲醇0.05M醋酸钠(pH 6.2)(5 75 420，V/V)。梯度洗脱程序见下表
权利要求
1.一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列在第311位有定点突变。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列第311位的密码子GGT突变为CCC。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因编码的谷氨酸脱羧酶。
5.根据权利要求4所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
6.ー种包含权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因的谷氨酸脱羧酶表达单元。
7.ー种包含权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因的重组质粒。
8.ー种包含权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因的转化子。
9.权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因在60°C以上条件下、催化L-谷氨酸或其盐生成Y -氨基丁酸的方法中的应用。
10.权利要求4或5所述的谷氨酸脱羧酶在60°C以上条件下、催化L-谷氨酸或其盐生成Y-氨基丁酸的方法中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因，其核苷酸序列在第311位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60℃和70℃下的热稳定性。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
文档编号C12N9/88GK103031322SQ20111029715
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者梅乐和, 郁凯, 胡升, 黄 俊 申请人:浙江大学宁波理工学院