专利名称：加强细胞生长抑制药凋亡作用的5－取代核苷的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA修复基因和/或癌基因的至少一种超表达抑制剂用于生产提高化疗后细胞生长抑制剂的凋亡作用的药物的用途。
人类癌症是最常见的死亡原因，而化疗是最常用的治疗方法。化疗治疗治愈率不够高是由于耐药性的产生。这些耐药性的根源在于细胞生长抑制剂影响基因表达并且具有基因毒性作用，例如引起突变、基因扩增和重组，并因此使基因组不稳定。这样，化疗导致或选择耐药性癌细胞。通常癌基因如Ras、Bcl2、Bcr-abl、Myc、ErbB2等受细胞生长抑制剂所致效应的影响。错误受控的基因表达连同DNA修复和重组一起也导致化疗耐性(例如p53基因、BRCA1/2、UBE2N、APEX和Rad51)，此外代谢和生物激活细胞生长抑制剂的酶(例如DHFR、DT-黄递酶(DT-D))或运送细胞生长抑制剂的蛋白质(例如MDR1)也导致化疗耐性。
大多数细胞生长抑制剂消除肿瘤是因为其导致凋亡。凋亡是一种程序化细胞死亡的形式，首先记述在Kerr，J.F.et al.，Br J Cancer，26(4)(1972)；239-257中。与坏死相反，凋亡是细胞死亡的生理形式。这两种形式的细胞死亡可通过坏死和凋亡之间的差异来区分。凋亡具有连续发生有序级联事件的确定的形态学和生物化学特征。该连续过程可划分为多个阶段。凋亡的形态学特征为核染色质凝聚(核固缩)、细胞质收缩、凋亡囊泡和最终的凋亡小体形成。肿瘤细胞可以通过过度活化存活机制而防止凋亡。因此，化疗耐性还包含抗细胞凋亡作用基因，例如STAT3，即激活的“转录信号转导物和活化物3”，或者JUN-D。
1995年发现了此前未知的特定激素和5-取代核苷的作用。其抑制中国仓鼠细胞中2-氨基-6-巯基嘌呤(AMP)诱导的SV40扩增(Fahrig，R.et al.，Mutat Res.，356(2)，1996，217-224)和酵母菌中三乙撑三聚氰酰胺诱导的重组(Fahrig，R.，Mutat Res.，372(1)，1996，133-139)。在EP 0 806 956 B1中描述了用5-取代核苷治疗小鼠白血病细胞，抑制了阿霉素(亚德里亚霉素)诱导的Mdr1基因扩增和化疗耐性。
迄今为止所进行的体外试验中，5-取代核苷(即碱基类似物)总是与一种或多种细胞生长抑制剂一起应用。
从本文所述的现有技术出发，本发明的目的是防止由耐药性形成所致的细胞凋亡作用下降或至少延迟这种下降，从而提供相对于现有技术的已知疗法改进的治疗方法。
该目的通过权利要求1所述的用途实现。其他从属权利要求说明了有利的方案。
根据本发明，提供了DNA修复基因和/或癌基因的至少一种超表达抑制剂用于生产提高化疗后细胞生长抑制剂的凋亡作用的药物的用途。
值得注意的是，上述所有的DNA修复基因UBE2N和/或APEX、DDX1、STAT3和/或JUN-D都是癌基因。
优选的是，将5-取代核苷、其受保护形式、盐或前药用作超表达抑制剂。
优选的是，在化疗中联合使用至少一种细胞生长抑制剂和DNA修复基因和/或癌基因的至少一种超表达抑制剂或包含超表达抑制剂的药物。
对于5-取代核苷，使用(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷(BVDU)，可以使用其受保护形式、其盐和/或前药。根据本发明的BVDU前药的实例由以下通式I表示 优选的是，5-取代核苷的所用剂量应使其血液浓度为0.02-50μg/ml。
令人惊奇的是，能够证明在化疗完成之后，如果细胞进一步单独用5-取代核苷(碱基类似物)治疗，其生长受抑制程度会比用细胞生长抑制剂继续化疗更高。完全出乎预料的是，5-取代核苷(碱基类似物)的效果上升而非下降。
根据本发明利用筛选体系确定了该效果。该筛选方法为基于在优选8-30天的化疗周期期间用剂量逐渐增加的细胞生长抑制剂和恒定剂量的超表达抑制剂治疗肿瘤细胞。在该组合处理之后，中断细胞生长抑制剂，仅使用超表达抑制剂治疗。该恢复期(亦称恢复阶段)优选持续3-10天。这类化疗周期可连续进行至多6次。
结果，产生了令本领域技术人员惊奇的治疗方式的格局。
—单独给予5-取代核苷显示无效。
—5-取代核苷与细胞生长抑制剂共同施用有效。
—在5-取代核苷先与细胞生长抑制剂共同施用之后再单独使用5-取代核苷，表现出更高的效果。
该效果，即抑制化疗耐性和增加化疗敏感性，可以描述为通过影响特定基因的基因表达对细胞生长抑制剂所致凋亡的无毒保持。其发生是通过1、阻断恢复期的“存活通路”。
2、阻断相关酶的DNA修复。
3、引起DT-黄递酶的活性。
4、减少恢复期内生成ATP的酶的表达。
对于1)，碱基类似物如BVDU理论上在中断细胞生长抑制剂之后的联合治疗的恢复阶段阻断“存活通路”，从而促进凋亡进程。
利用大鼠AH13r肿瘤细胞的HOPI双染色，可以检测到诸如阿霉素(DOX)、米托蒽醌(MXA)或丝裂霉素C(MMC)的细胞生长抑制剂引起凋亡。和碱基类似物(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷(BVDU)的联合治疗通过阻断包括STAT3和JUN-D的抗凋亡“存活通路”来促进凋亡。
该效应首先发生在细胞的恢复期，如实施例2所见。
组成型激活的STAT3具有致癌效应，导致不同的人类癌症的发声。这通过抑制凋亡而发生。这样，STAT3促进肿瘤细胞的生存，并使细胞抵抗化疗。
相应地，抑制“STAT3信号转导”引起凋亡，增加对细胞生长抑制剂的敏感性。
作为JUN基因家族一员的JUN-D是广泛表达的“激活蛋白-1”(AP-1)转录因子复合体的基本组分。JUN-D(-/-)原代成纤维细胞表现出UV辐射或TNFα治疗之后的早熟老化和凋亡增加。该结果导致JUN-D激活“NF-кB存活通路”的假定。此外，由JUN-D直接调节的p202使得成纤维细胞能够抵抗凋亡。
通过BVDU的联合治疗减少两种JUN-D亚型的表达约四分之一。相反，STAT3在恢复期受调节约三分之二(实施例2)。
用丝裂霉素C联合治疗之后的恢复期内的效过尤为印象深刻。在此，碱基类似物减少癌基因JUN-D的超表达至对照水平(实施例2)。
对于2)，碱基类似物如BVDU阻断DDX1。DDX1与MYCN共同扩增，并且在成神经细胞瘤(NB)和成视网膜细胞瘤细胞系和肿瘤中超表达。DDX1和MYCN扩增的NB患者具有比仅有MYCN基因扩增的患者更差的预后。DDX1因此具有致癌潜力。
MMC与BVDU的联合治疗减少UBE2N和APEX的超表达约三分之一。UBE2N的修饰影响对DNA损伤的耐受性。APEX核酸酶是DNA修复酶。阻断APEX表达加倍细胞溶解并增加DNA断裂。
对于3)，BVDU诱导DT-黄递酶(实施例3)。DT-黄递酶具有两种对于化疗非常重要的性质。一方面，它激活来自醌类的细胞生长抑制剂，另一方面，减少基于活性氧物质产生的非特异性毒性效应。
缺少DT-D基因通过减少p53和p73表达导致骨髓增生和相应地凋亡速率减小。这与所观察到的肿瘤细胞多因子“多药耐药性”表型涉及DT-黄递酶的减少而非增加相一致。令人感兴趣的是，DT-D酶活性也稳定了淋巴细胞群。该效应可对化疗期间患者免疫系统的稳定具有有利影响。
许多细胞生长抑制剂，例如DOX和MXA，破坏癌细胞的氧化还原态和线粒体呼吸。这导致生成活性氧物质(ROS)。不仅癌细胞而且所有其他细胞均受ROS突然积聚所影响，其结果是化疗中发生不期望的副作用。
DT-D使ROS失活，因而保护细胞免受非特异性ROS和亲电子攻击。作为对于化疗期间减少不希望的副作用的该BVDU作用的指标，在实施例4中引用了阿霉素+BVDU治疗的大鼠体重增加。由于毒性副作用，单独的DOX治疗导致体重下降。显然使用BVDU仅减少了副作用(可能是DOX的心脏中毒特性)，但未减少对肿瘤的毒性作用。
对于4)，通过改变恢复期不同酶的表达，没有细胞生长抑制剂时也保持了细胞生长抑制作用。如在实施例5中可见，8种基因的表达增加，6种基因的表达下降。
基因产物影响微丝形成、分化、信号转导和ATP产生。
参照以下附图和实施例详细说明根据本发明的主题，而非限制所述主题于所提及的实施方案。
图1示出细胞生长抑制剂单独使用以及和BVDU组合使用对AH13r细胞的作用。
图2对比图1，示出使用阿霉素(DOX)、米托蒽醌(MXA)和氨甲蝶呤(MTX)的结果。
图3示出用阿霉素(DOX)测试“存活通路”的Western印迹分析。
图4示出对应于图3用丝裂霉素(MMC)的测试。
图5示出DT-黄递酶DT-D、阿霉素(DOX)单独使用或与BVDU一起使用的测量结果。
图6示出对应于图5用氨甲蝶呤(MTX)的测试。
实施例1BVDU治疗增加AH13r肉瘤细胞对化疗引起的凋亡的敏感性。该效应甚至在所谓恢复期内中断细胞生长抑制剂后也得以保持。
AH13r细胞经受递增剂量的细胞生长抑制剂丝裂霉素C(MMC)。单独给予BVDU显示无毒性作用。MMC+BVDU治疗在三次治疗周期之后导致细胞数量相比于单独使用MMC治疗下降。这种抑制作用甚至在所谓恢复期内的下一周期中中断细胞生长抑制剂之后依然得以保持。未用MMC和BVDU的细胞继续生长而未受抑制。然而，继续接受BVDU的这些细胞的生长大大受到抑制(见图1)。
使用阿霉素(DOX)、米托蒽醌(MXA)和氨甲蝶呤(MTX)得到相应的结果(见图2)。
细胞数减少的指标基于凋亡，利用Hoechst 33258/碘化丙锭(Hopi)双染色检测。
实施例2我们利用Western印迹分析测试了不同的“存活通路”。该分析根据标准方法进行，如Sambook et al，2001，Molecular Cloning(第三版)中所述。抗体稀释液P-STAT3(细胞信号转导)1∶500，JUN-D(Santa Cruz，California)1∶1000。两个JUN-D带中上面的显示“全长亚型”，下面的“截短的亚型”短了48个氨基酸。两种亚型均可激活转录，但“全长”变体比“截短的”亚型更为有效。(参见图3)。
恢复期(r＝恢复期)中DOX治疗之后，癌基因蛋白JUN-D和STAT3通过光密度计量测定的含量下降四分之一或三分之二。在“恢复”中仅给予BVDU，没有细胞生长抑制剂。
在用丝裂霉素C(MMC)的测试中得到相应的结果(见图4)。
在用丝裂霉素C(MMC)的测试中，在“恢复”中给予的BVDU的作用是将MMC引起的JUN-D超表达完全抑制到对照水平。
实施例3DT-黄递酶(DT-D)的测定如可受双香豆素抑制的NAD(P)H二氯苯酚靛酚还原酶进行，如Hodnick et al.，Anal.Biochem 252(1)，1997，165-168所述。我们对类似数目的已用DOX+/-BVDU处理过的细胞的提取物进行了检测。以BVDU处理的细胞表现出相对于来自对照组和来自单独用DOX处理的细胞组约3倍的活性(见图5)。
用米托蒽醌(MXA)和氨甲蝶呤(MTX)得到相应的结果。单独使用BVDU稳定增加DT-D活性，但在某种程度上仅少量增加。
图6中引用了使用氨甲蝶呤(MTX)和人K562肿瘤细胞的结果。MB表示MTX和BVDU，传代意味着稀释和转移细胞以进一步生长。相对DT-D活性示于Y轴。
实施例4阿霉素(DOX)的毒性副作用下降可表现在利用大鼠的试验中(见表1)。SD大鼠用二甲基苯并蒽(DMBA)处理。通过DOX治疗(1mg/kg)抑制了因此而引致的肿瘤的生长。治疗期间和每次治疗后一天，即恢复期，所述动物分别得到15mg/kg的BVDU。
表1
实施例5列出受碱基类似物和丝裂霉素C处理影响的蛋白质。进行双向凝胶电泳的结果汇编于下表2。
表权利要求
1.DNA修复基因和/或癌基因的至少一种超表达抑制剂用于生产提高化疗后细胞生长抑制剂的凋亡作用的药物的用途。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述修复基因为UBE2N和/或APEX。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述癌基因是DDX1、STAT3和/或JUN-D。
4.根据权利要求1-3之一的用途，其特征在于5-取代核苷、其受保护形式、盐或前药用作超表达抑制剂。
5.根据权利要求1-4之一的用途，其特征在于在化疗期间至少一种细胞生长抑制剂和DNA修复基因和癌基因的至少一种超表达抑制剂联用。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于5-取代核苷用作超表达抑制剂。
7.根据权利要求5或6的用途，其特征在于化疗期间，联合使用在限定的时间期间递增剂量的细胞生长抑制剂和恒定剂量的超表达抑制剂，在化疗之后，即恢复期内，单独使用超表达抑制剂。
8.根据权利要求7的用途，其特征在于恢复期的持续时间为3-10天。
9.根据权利要求5-8之一的用途，其特征在于化疗周期的持续时间为8-30天。
10.根据权利要求1-9之一的用途，其特征在于(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷(BVDU)、其受保护形式、盐和/或前药用作5-取代核苷。
11.根据权利要求10的用途，其特征在于通式1的化合物用作前药。
12.根据权利要求1-11中至少一项的用途，其特征在于使用至少一种5-取代核苷的所用剂量应使得其在血液中的浓度为0.02-50μg/ml。
全文摘要
本发明涉及DNA修复基因和癌基因的至少一种超表达抑制剂用于生产用来提高化疗后细胞生长抑制药的凋亡作用的药物的用途。
文档编号A61P35/00GK1758918SQ200380110201
公开日2006年4月12日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年3月24日
发明者鲁道夫·法里希, 约尔格-克里斯蒂安·海因里希, 格奥尔格·克鲁皮察 申请人:雷斯普罗泰克特有限公司