一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程、代谢工程及合成生物学领域，具体涉及一种酿酒酵母染色 体及其构建方法与应用；尤其涉及一种可实现多基因、多代谢通路、可扩展并无需筛选，且 稳定存在的酿酒酵母染色体及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着现代生物技术和生物医药的发展，利用外源系统表达及获取高附加值产物的 应用越来越普遍。著名的成功案例包括青蒿素的发酵生产等。传统的表达系统是利用微生 物如大肠杆菌、枯草杆菌和酿酒酵母等底盘生物，通过放入这些系统中原本不存在的酶基 因，从而利用这些系统中原本已经存在的代谢产物，获取所需的目标产物。通过进一步的优 化，最终获得较高产量和质量的产品。为了实现外源基因在这些体系中的表达，通常需要将 多个基因从其他生物中PCR扩增出来，然后放入宿主细胞内进行表达。常见的将多个外源 基因放入宿主系统的方法有：1)将多个基因分别克隆在单独的载体上，然后将各带有外源 基因的载体转化进入同一个细胞；2)将多个基因分步克隆到同一个载体上，然后转化进入 细胞；3)将多个基因分别转化，整合到宿主基因组中。
[0003] 早期的代谢工程方法是将所需要表达的基因，利用分子生物学的方法，从该基因 的源物种中扩增，并克隆在载体上。如果同时需要表达多个基因，可以采用相同的策略，将 各个基因分别克隆到带有不同抗性标记的载体上，每个基因都通过相同或者不同的启动子 等生物元件进行调控。然后将构建好的质粒分步、或者共同转化到宿主细胞（通常是大肠 杆菌）内，通过对抗性标记的筛选，获得带有这几个外源基因的菌株。
[0004] 因为可供选择的抗性基因数目有限，所以采用上述方法进行外源基因的表达受到 局限。为此，人们又开发了新的方法，即将多个基因，分步克隆到同一个载体上。这样只需 要一种抗性载体，就可以同时转入多个基因。利用该方法，人们可以同时表达较大数量的外 源基因。
[0005] 将多个基因克隆在同一个载体上解决了部分因为基因数目的限制，但和单独的载 体表达一样，对最后获得菌株必须保持抗性的筛选。一旦筛选压力消失，菌株所携带的外源 基因会很快的被丢失掉。而抗生素等的使用，也对极大的提高了工业生产成本。为了获得 稳定的表达体系，剔除对抗生素等筛选压力的需求，一个解决办法是将这些外源基因整合 到宿主基因组上。但整合到染色体上的一个局限就是能够整合的基因拷贝数低，能够整合 的基因数目小，因此产品表达量少，很难满足工业大量生产的目的。
[0006]因为大肠杆菌等细菌生长速度快，基因组相对简单，分子操作技术成熟，所以它们 很早就被用于各种代谢工程的宿主。与此同时，酿酒酵母作为一种简单的真核微生物，因为 其遗传背景清楚，遗传操作方便，被广泛的用作为真核表达系统。此外，酵母被认为是一种 安全的微生物，比大肠杆菌等更有利对食品相关等产品的生产。另外，酵母具有一个强大的 同源重组系统，可以利用仅仅几十个碱基对的同源序列，进行准确和高效的同源重组，从而 可以更为快捷的进行多基因、大片段DNA的组装。
[0007] 因此，为了提高外源基因在酵母中的表达量、稳定性，可以将它们整合到基因组 中，而且必须保证这些基因可以在必要的情况下能够提高拷贝数，并且实现对整合进入基 因组的基因进行增加、筛减乃至扩展新的多基因簇。与此同时，必须保证营养缺陷型标记的 最少量使用，并且可以在不进行筛选的情况下进行正常和稳定的生长。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种酿酒酵母人工染色体。
[0009] 本发明提供的酿酒酵母人工染色体包括n个重复重组盒、2个端粒重复序列、2个 隔离子序列、着丝粒-自主复制序列和P〇130基因；
[0010] 每个所述重复重组盒由上游重组目标序列、报告基因、筛选标记基因和下游重组 目标序列组成；所述报告基因和所述筛选标记基因均位于所述上游重组目标序列和所述下 游重组目标序列之间；所述n为大于等于1的自然数。
[0011] 所述上游重组目标序列和所述下游重组目标序列是与酿酒酵母人工染色体上其 余部分均不发生同源重组的序列。
[0012] 上述酿酒酵母人工染色体中，
[0013] 所述n为1或2;
[0014] 所述酿酒酵母人工染色体从上游至下游依次包括一个端粒重复序列、一个隔离子 序列、第一个重复重组盒、着丝粒-自主复制序列、P〇130基因、第二个重复重组盒、另一个 隔离子序列和另一个端粒重复序列；
[0015] 或所述酿酒酵母人工染色体从上游至下游依次包括一个端粒重复序列、一个隔离 子序列、第一个重复重组盒、着丝粒-自主复制序列、P〇130基因、另一个隔离子序列和另一 个端粒重复序列。
[0016] 上述酿酒酵母人工染色体中，
[0017] 所述端粒重复序列均为序列表中序列1 ;
[0018] 所述隔离子序列均为序列表中序列2 ;
[0019] 所述着丝粒-自主复制序列为序列表中序列4;
[0020] 所述po130基因序列为序列表中序列6 ;
[0021] 所述报告基因为RFP基因；
[0022] 所述筛选标记基因为TRP1基因；
[0023] 所述第一个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列9 ;
[0024] 所述第一个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列10 ;
[0025] 所述第二个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列11 ;
[0026] 所述第二个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列12 ;
[0027] 所述第一个重复重组盒的序列为序列表中序列15 ;
[0028] 所述第二个重复重组盒的序列为序列表中序列16。
[0029] 本发明的另一个目的是提供一种酿酒酵母人工染色体的制备方法。
[0030] 本发明提供的酿酒酵母人工染色体的制备方法为将n个重复重组盒整合到 PNE0C14载体中，得到酿酒酵母人工染色体。
[0031] 上述方法中，
[0032] 每个所述重复重组盒由上游重组目标序列、报告基因、筛选标记基因和下游重组 目标序列组成；所述报告基因和所述筛选标记基因均位于所述上游重组目标序列和所述下 游重组目标序列之间；所述n为大于等于1的自然数。
[0033] 上述方法中，所述方法包括如下步骤：将n个重复重组盒转入含有线性化的 PNE0C14载体的酿酒酵母中，得到重组菌，提取所述重组菌的质粒，即得到酿酒酵母人工染 色体；
[0034] 所述含有线性化的PNE0C14载体的酿酒酵母为将线性化的pNE0C14载体转入宿主 酿酒酵母得到的中间菌；
[0035] 所述线性化的PNE0C14载体为用限制性内切酶PmeI酶切pNE0C14载体后得到的 线性DNA分子；
[0036] 所述PNE0C14载体的核苷酸序列为序列表中序列7所示的环状DNA分子。
[0037] 上述方法中，
[0038] 所述n为1或2 ;
[0039] 所述端粒重复序列均为序列表中序列1 ;
[0040] 所述隔离子序列均为序列表中序列2 ;
[0041] 所述着丝粒-自主复制序列为序列表中序列4 ;
[0042] 所述po130基因序列为序列表中序列6 ;
[0043] 所述报告基因为RFP基因；
[0044] 所述筛选标记基因为TRP1基因；
[0045] 所述第一个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列9 ;
[0046] 所述第一个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列10 ;
[0047] 所述第二个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列11 ;
[0048] 所述第二个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列12 ;
[0049] 所述第一个重复重组盒的序列为序列表中序列15所示；
[0050] 所述第二个重复重组盒的序列为序列表中序列16所示。
[0051 ] 上述方法中，所述酿酒酵母为基因组上敲除p〇130基因，且含有URA-p〇130质粒的 酿酒酵母JDY52 ;所述URA-p〇130质粒的核苷酸序列如序列表中序列8所示。
[0052] 本发明还有一个目的是提供一种DNA片段。
[0053] 本发明提供的DNA片段为上述重复重组盒。
[0054] 本发明还有一个目的是提供一种含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌。
[0055] 本发明提供的含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌为将上述酿酒酵母人工染色体 导入酿酒酵母中得到的酵母菌。
[0056] 上述酿酒酵母人工染色体或上述DNA片段或上述含有酿酒酵母人工染色体的酵 母菌在表达外源基因中的应用也属于本发明的保护范围。
[0057] 上述酿酒酵母人工染色体或上述DNA片段或上述含有酿酒酵母人工染色体的酵 母菌在制备表达外源基因的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0058] 本发明的最后一个目的是提供一种表达外源基因的方法。
[0059] 本发明提供的表达外源基因的方法包括如下步骤：将含有外源基因的DNA片段导 入上述含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌中，得到重组菌A，培养所述重组菌A，实现外源 基因的表达；
[0060] 所述外源基因的DNA片段包括上游同源臂、外源基因表达盒、筛选标记基因和下 游同源臂；
[0061] 所述上游同源臂为所述酿酒酵母人工染色体的重复重组盒的上游重组目标序 列；
[0062] 所述下游同源臂为所述酿酒酵母人工染色体的重复重组盒的下游重组目标序列。
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