楝树染色体加倍方法
【专利摘要】本发明涉及一种楝树染色体加倍方法。本发明技术方案是采集楝树外殖体，消毒灭菌，将殖体进行培养，诱导产生愈伤组织并分散成悬浮细胞进行悬浮培养，处理愈伤组织，染色体加倍，将愈伤组织转接到初代培养基中进行培养，再转接到生芽培养基中诱导不定芽，将不定芽放入增殖培养基中进行培养，接种到生根培养基中进行生根培养，用椰糠和土配成的混合基顾进行炼苗，筛选出加倍后的植株种苗。本发明克服了不能有效的对楝树等木本植物进行染色体加倍的缺陷。本发明培育出的多倍体楝树果实大，产量高，含楝素高，植株健壮粗大，能够有效提高楝树的利用率，大大减少了其生产的成本，提高了经济价值。
【专利说明】楝树染色体加倍方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术育种领域，专用于楝树的染色体工程和倍性育种，特别涉及一种楝树染色体加倍方法。
【背景技术】
[0002]楝树具有极高的经济价值，特别是所含有效的化学物质如楝素等，但天然楝树的果实比较小，其中的楝素也就很少。因此如何提高楝树果实的大小，以及果实中有效化学物质的含量成为楝树エ业发展的瓶颈。
[0003]在本发明之前，没有专门针对楝树的染色体加倍方法。其他染色体加倍的方法例如丹參染色体加倍方法等都只针对草本植物，不能有效的对楝树等木本植物进行染色体加倍，本发明解决了楝树的染色体加倍的技术难题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种楝树染色体加倍方法。
[0005]本发明的技术方案是:
[0006]楝树染色体加倍的方法，其主要技术特征在于以下步骤:
[0007](I)采集楝树外殖体；
[0008](2)用消毒试剂对楝树外植体灭菌；
`[0009](3)将楝树外殖体转接到培养基中进行培养，诱导产生愈伤组织；
[0010](4)将愈伤组织分散成悬浮细胞，进行悬浮培养；
[0011 ](5)使用化学物质处理愈伤组织，实现染色体加倍；
[0012](6)将染色体加倍的愈伤组织转接到初代培养基中进行培养；
[0013](7)将愈伤组织转接到生芽培养基中诱导不定芽；
[0014](8)将分化出的不定芽放入増殖培养基中进行培养；
[0015](9)接种到生根培养基中进行生根培养；
[0016](10)用椰糠和土配成的混合基质进行炼苗，炼苗后移栽；
[0017](11)进行染色体数目观察，筛选出加倍后的植株种苗。
[0018]本发明的优点和效果在于培育出的多倍体楝树果实大,产量高,含楝素高，植株健壮粗大，能够有效提闻棟树的利用率，大大减少了其生广的成本，提闻了经济价值。
[0019]本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
【具体实施方式】
[0020]本发明的技术思路是:
[0021]多倍体植株大多比较粗壮，产量明显提高，抗寒、抗旱、抗病能力加强，具有一定的优越性。但是在自然界中多倍体自发情况极少，而且发生的变异大多不定向。本发明用化学物质秋水仙素处理愈伤组织从而诱导多倍体，利用的是愈伤组织分化程度低、细胞分裂快、再生能力强的特点。不仅可以大大缩短所需时间，诱发成功率高，而且材料易得，易处理。大致流程如下:外植体一愈伤组织一多倍体植株一检验一扩繁。
[0022]本发明方法包括以下具体步骤:
[0023](1)外殖体采集:选择睛朗的天气，在上午叶面无露水时进行采集。挑选健壮、无病虫害的植株，用较锋利的剪刀剪下枝梢半木质化部分，切除顶梢幼嫩段，只保留半木质化段。在腋芽上下3cm处切下腋芽，并只保留3cm左右的叶柄，切ロ要求平滑不裂，以利于随后的消毒处理。
[0024](2)外殖体消毒:将上述采集的外殖体在无菌的情况下，采用特别配制的消毒试剂进行消毒，处理方法为:
[0025]方法一洗洁精冲洗3遍，0.1 %~0.2%高锰酸钾35min，10%~20%次氯酸钠溶液Ih (加1%吐温20)，1~3%山农一号I型与抗生素溶液lh，其中抗生素含链霉素、头孢霉素、制霉菌素，且浓度均为3~7%，75%こ醇30秒，每个试剂处理后均要用无菌水冲洗3遍。
[0026]方法二洗洁精冲洗3~5遍，75%こ醇30秒，10%次氯酸钠溶液lh，1%氯化汞溶液IOmin,姆个试剂处理后均要用无菌水冲洗3遍。
[0027](3)诱导产生愈伤组织:每隔14天，将外殖体转接到新的愈伤组织的培养基中，该培养基在正常的MS培养基中添加了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，6-BAl.5mg,NAA0.025mg，水至I升，调整pH至5.8~6.2。25±2°C培养，无需光照。
[0028](4)悬浮细胞培养愈伤组织:将愈伤分散后,接种在液体培养中上，125rpm振荡培养。姆隔3~5天换一次培养基,一段时间后观察愈伤状态。悬浮细胞培养的培养基配方为:MS培养基中添加了蔗糖40g，6-BAl.5mg,NAA0.025mg，水至I升，调整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培养，无需光照。
[0029](5)使用化学物质处理愈伤组织诱导染色体加倍:在无菌环境下，分别将愈伤组织、幼苗、悬浮细胞的混合物用0.25%浓度的秋水仙素溶液处理2.5h，秋水仙素溶液内需加入I %的二甲基亚砜两滴。处理后用无菌水冲洗2~3次。
[0030](6)挑选愈伤组织进行初代培养:挑选细胞分裂快，结构疏松，顔色浅而透明的愈伤组织转接到初代培养基中。每月转接一次，大概培养2~3个月。该培养基为MS基本培养基添加了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，TDZ0.2mg，三农一号II型2ml，活性炭1.5g，水至I升，调整pH至5.8~6.2。25±2°C和2000Iux光照条件下或日光灯照明培养，也可使用LED红灯作为光源进行培养。每天提供24h光照。
[0031](7)利用愈伤组织诱导不定芽:将愈伤组织放入培养基中诱导不定芽，20~25天转接一次。该培养基为3 / 2MS培养基中加入了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，6-BA0.5mg，NAA0.15mg，水至I升，调整pH至5.8~6.2。培养条件为:25±2°C和2000Iux光照条件下或日光灯照明培养，也可使用LED红灯作为光源进行培养。每天提供24h光照。
[0032](8)增殖培养:转接到增殖培养基后每25~30天转接一次。该培养基为3 / 2MS培养基中加入了鹿糖40g,卡拉胶7.5g, 6-BA0.5mg,NAA0.15mg,水至I升,调整pH至5.8~
6.2。培养条件为:25±2°C和2000Iux光照条件下或日光灯照明培养，也可使用LED红灯作为光源进行培养。每天提供16h光照。
[0033](9)生根培养:挑选较粗壮的植株，切去叶柄，将枝干切成4~5cm的小段,接种到生根培养基中。该培养基在正常的MS培养基中加入了蔗糖40g，卡拉胶5g，IBA0.15mg /L，水至I升，调整pH至5.8~6.2。
[0034]置于20~28°C和1000~3000Iux光照条件下或日光灯或LED红光灯作为照明光源培养。每天提供16~24h光照。
[0035](10)出瓶移栽:移栽组培苗可用椰糠:土 =1:1的土壤作为基质。在植株的根长至3~5cm长时，即可出瓶移栽。移栽前先将瓶苗置于荫棚中训化培养7~10天，开盖后再放置3~5天。移栽时用竹筷或镊子将瓶苗轻轻取出，洗净培养基后用1%。的多菌灵浸泡7min,栽入育苗杯中,浇透水后用地膜覆盖,培养。
[0036](11)染色体检测:取候选加倍楝树植株的茎尖或根尖组织，进行染色体数目观察，筛选加倍植株的楝树种苗，以便用于进一步扩繁生产。
[0037]实施例:
[0038](I)在上午叶面无露水时，选取健壮、无病虫害的楝树植株，取顶稍幼嫩段的外殖体20个。
[0039](2)将上述外殖体用消毒试剂进行消毒。消毒试剂采用及处理时间如下:洗洁精冲洗3遍，0.2%高锰酸钾20min，10%次氯酸钠溶液1.5h (加I %吐温20)，培养基中加过滤的1%山农一号I型与抗生素溶液2.5h(其中含链霉素、头孢霉素、制霉菌素,且浓度均为3% )，75%乙醇20秒，每个试剂处理后均要用无菌说冲洗3遍。
[0040](3)每隔14天，将外殖体转移到新的愈伤组织的培养基中。该培养基是在正常MS培养基中加鹿糖40g,卡拉胶7.5g, 6-BA0.5mg,NAA0.05mg,水至I升,调整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培养，无需光照。
`[0041](4)将愈伤组织分散后悬浮，接种在液体培养基中，进行震荡培养。每隔3~5天更换培养基。培养基为MS培养基中添加了蔗糖40g，6-BA0.5mg, NAA0.05mg，水至I升，调整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培养，无需光照，摇床转速150rpm。
[0042](5)在无菌环境下，分别将愈伤组织，幼苗，悬浮细胞的混合物用0.1 %浓度的秋水仙素溶液浸泡处理5h，秋水仙素溶液内需加入1%的二甲基亚砜两滴。处理后用无菌水冲洗2~3次。
[0043](6)将外殖体转接到初代培养基中，每月转接一次，大概培养2~3个月。该培养基为MS基本培养基添加了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，TDZ0.2mg，三农一号II型1ml，活性炭
0.5g，水至I升，调整pH至5.8~6.2。25±2°C和2000Iux光照条件下或日光灯照明培养，也可使用LED红灯作为光源进行培养。每天提供24h光照。
[0044](7)将愈伤组织放入培养基中诱导不定芽，20天转接一次。该培养基为3 / 2MS培养基中加入了鹿糖40g,卡拉胶7.5g, 6-BA0.3mg,NAA0.05mg,水至I升,调整pH至5.8~
6.2。培养条件为:25±2°C和2000Iux光照条件下或日光灯照明培养，也可使用LED红灯作为光源进行培养。每天提供24h光照。
[0045](8)每25天转接一次到增殖培养基中。该培养基为3 / 2MS培养基中加入了蔗糖40g,卡拉胶7.5g, 6-BA0.3mg,NAA0.05mg,水至I升,调整pH至5.8~6.2。培养条件为:25±2°C和2000IUX光照条件下或日光灯照明培养，也可使用LED红灯作为光源进行培养。每天提供16h光照。
[0046](9)挑选较粗壮的植株，切去叶柄，将枝干切成4cm的小段，接种到生根培养基中。该培养基在正常的MS培养基中加入了蔗糖60g，卡拉胶7.5g，IBA0.05mg / L，水至I升，调整pH至5.8~6.2。置于25±2°C和2000Iux光照条件下或日光灯或LED红光灯作为照明光源培养。每天提供16光照。
[0047](10)移栽组培苗用椰糠:土壌=I:1的土壤作为基质。在植株的根长至4cm长时，出瓶移栽。移栽前先将瓶苗置于荫棚中训化培养7天，开盖后再放置3天。移栽时用镊子将瓶苗轻轻取出，洗净培养基后用1%。的多菌灵浸泡5min，栽入育苗杯中，浇透水后用地膜
覆盖，培养。
[0048](11)取加倍后楝树植株的茎尖或根尖组织，进行染色体数目观察，筛选加倍植株的楝树种苗， 以便用于进ー步扩繁生产。
[0049]本发明要求保护的范围并不仅仅局限于上述【具体实施方式】的说明。
【权利要求】
1.楝树染色体加倍方法，其特征在于以下步骤: (1)采集楝树外殖体； (2)用消毒试剂对楝树外植体灭菌； (3)将楝树外殖体转接到培养基中进行培养，诱导产生愈伤组织； (4)将愈伤组织分散成悬浮细胞，进行悬浮培养； (5)使用化学物质处理愈伤组织,实现染色体加倍； (6)将染色体加倍的愈伤组织转接到初代培养基中进行培养； (7)将愈伤组织转接到生芽培养基中诱导不定芽； (8)将分化出的不定芽放入增殖培养基中进行培养； (9)接种到生根培养基中进行生根培养； (10)用椰糠和土配成的混合基质进行炼苗，炼苗后移栽； (11)进行染色体数目观察，筛选出加倍后的植株种苗。
2.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(2)中，消毒试剂包括:洗洁精，高锰酸钾，次氯酸钠溶液，无菌水，山农一号I型，抗生素溶液，75 %乙醇，氯化汞。
3.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(3)中的培养基在正常的MS培养基中添加了鹿糖40g,卡拉胶7.5g, 6-BA0.5~2mg,NAA0.01~0.05mg,水至I升，调整pH至5.8~6.2。
4.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(4)中悬浮培养的培养基在正常的MS培养基中添加了蔗糖40g，6-BA0.5~2mg，NAA0.01~0.05mg，水至I升，调整pH至5.8~6.2，摇床转速100~150rpm。
5.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(5)中的化学物质为秋水仙素；处理浓度与方法为:在无菌环境下将浓度为0.1~0.5%的秋水仙素药液过滤，再把经过悬浮培养的愈伤组织浸泡于上述药液中处理I~5h，之后用无菌说冲洗2~3次。
6.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(6)中的初代培养基的配方为:MS基本培养基添加了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，TDZ0.1~0.3mg,山农一号II型I~3ml，活性炭0.5~2g，水至I升，调整pH至5.8~6.2。
7.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(7)中的生芽培养基配方为:3 / 2MS培养基中加入了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，6-BA0.3~0.7mg，NAA0.05~0.2mg，水至I升，调整pH至5.8~6.2。
8.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(8)中的增殖培养基配方为:3 / 2MS培养基中加入了蔗糖40g，卡拉胶7.5g，6-BA0.3~0.7mg，NAA0.05~0.2mg，水至I升，调 整pH至5.8~6.2。
9.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(9)中的生根培养基为MS培养基中加入了蔗糖40g，卡拉胶5~10g，IBA0.05-2mg / L，水至I升，调整pH至 5.8 ~6.2。
10.根据权利要求书I中所述的楝树染色体加倍方法，其特征在于步骤(10)中培养组培苗的混合基质的成分为椰糠和土壤混合物，混合比例为1:2~2:1。
【文档编号】A01H4/00GK103598088SQ201310403061
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】王台虎 申请人:南京大渊美容保健有限公司